本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。
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摘要
摘要
神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，开发出客观的方法来量化突触连接的变化已成为当务之急。本实验方案从样本固定开始，详细描述了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物以及脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记出突触前终末以及突触后特化结构的位点。我们将突触定义为这些标记物所产生的信号之间共定位的点。这些共定位点的数量通过ImageJ分析软件平台下的Puncta Analyzer插件（由Bary Wark编写，可应要求获取，c.eroglu@cellbio.duke.edu）进行量化。本方案中描述的突触检测方法可应用于任何具有选择性突触前和突触后标记物的神经组织或培养样本。该突触检测技术是一种有价值的工具，可在突触发育研究中广泛使用。
方案
需准备的溶液：
- 抗体缓冲液：
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No: BP152-5, 50 mM) - 1.21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat. No: A2153, 1%) - 2.0 g
- 100 mM L-lysine (Sigma, Cat. No: L-1137, 100 mM) - 3.65 g
- 调节 pH 至 7.4
- 0.04% 叠氮化钠
- 用蒸馏 H2O 定容至 200 ml。
- 用 0.22μm 滤器过滤（Millipore, Cat. No: SCGPU02RE）。
- PFA 稀释液：
- 168 ml 0.5 M Na2HPO4（碱性）
- 72 ml 0.5M Na2HPO4（酸性）
- 660 ml 蒸馏 H2O
- 用于培养神经元的 4% PFA 固定液（溶液 #2）：
- 10 ml 16% PFA 溶液（Electron Microscopy Sciences, Cat. No: 15711）
- 30 ml 4% PFA 稀释液（溶液 #2）
- PBS 中的 4% PFA：
- 4 g PFA（Electron Microscopy Sciences, Cat. No: 19210）
- 100 ml PBS（Invitrogen, Cat. No: 20012-027）
- 加热至 40°C，搅拌过夜。
- 用 0.22μm 滤器过滤（Millipore, Cat. No: SCGPU02RE）
- 封闭缓冲液（总体积（24 孔板）=（#盖玻片 + 1）× 200μl）
- 50% 抗体缓冲液（溶液 #1）
- 50% 正常山羊血清（Gibco, Cat. No: 16210）
- 0.2% Triton X-100（Roche Diagnostics Gmbh, Cat. No: 9002-93-1）
- PBS 中的 30% 蔗糖：
- 30 g 蔗糖（MP Biomedicals, Inc., Cat. No: 821713）
- 70 ml PBS（Invitrogen, Cat. No: 20012-027）
- 用磁力搅拌器搅拌至蔗糖完全溶解。
- 用 PBS 定容至 100 ml
- 用 0.22 μm 滤器过滤（Millipore, Cat. No: SCGPU02RE）
神经元培养物的制备：
本文所述方案适用于在24孔板（Falcon，货号：35-3047）中培养于12 mm玻璃盖玻片（Karl Hecht，编号：O，货号：99010）上的任何原代神经元培养。例如，在我们的实验室中，我们培养从出生后5至7天（P5-7）大鼠视网膜中分离纯化的视网膜神经节细胞（RGCs）1,2。细胞培养所用的玻璃盖玻片预先涂有聚-D-赖氨酸（Sigma，货号：P6407）和小鼠层粘连蛋白（Cultrex，货号：3400-010-01）。我们将这种培养体系用于突触检测实验中的多种不同用途。其中一种操作方式是将RGCs在存在或不存在星形胶质细胞分泌的突触生成因子的条件下进行培养。另一种方式则是将经过转染以过表达目标蛋白的RGCs应用于不同处理条件的实验中。在后一种情况下，我们会共转染一种细胞标记物（例如GFP或tdTomato）。这些不同的实验策略会影响突触检测中某些步骤的具体操作，下文将予以说明。
1. 固定分离纯化的RGCs
- 移除含有视网膜神经节细胞（RGC）的孔中培养基，向每孔加入500 μl（24孔板）预热至37°C的4%多聚甲醛（PFA）。室温下固定细胞7分钟。
- 固定后，用磷酸盐缓冲液（PBS）（Invitrogen，货号：20012-027）洗涤细胞3次。重要提示：细胞在孔中任何时候都不应处于无液体状态；一旦移除缓冲液，应立即加入下一种缓冲液。此时细胞已准备好进行免疫染色。
2. 封闭视网膜神经节细胞上的非特异性结合位点
- 准备封闭液，其中含50%正常山羊血清（NGS, Gibco, 货号: 16210）和0.2% Triton X-100（Roche Diagnostics Gmbh, 货号: 9002-93-1）。从每个孔中移除PBS后，向每孔加入200 μl封闭液，在室温下封闭30分钟。
- 移除封闭液，用PBS洗涤3次。
3. 加入一抗溶液
- 重要提示：务必选择来自不同物种的初级抗体，用于您的突触前和突触后标记物。
- 在含有90%抗体稀释液和10% NGS溶液的混合液中配制初级抗体工作液，其中加入您所选定的突触前和突触后抗体组合。例如，兔抗synapsin抗体（突触前标记物）（1:750，胞质区，Synaptic Systems）和小鼠抗Homer抗体（突触后标记物）（1:500，小鼠，Synaptic Systems）。重要提示：将初级抗体稀释液在台式离心机中以最大速度离心5分钟，以去除任何沉淀的抗体。
- 向每个孔中加入200 μl初级抗体溶液。
- 在4°C下孵育过夜。将培养板置于一个较大的、保持湿润的容器中，以防止初级抗体溶液干燥。暂停点：细胞可在初级抗体混合液中保存长达3天，之后再继续实验流程。
- 次日，从每个孔中移除初级抗体，并用PBS洗涤3次。
4. 应用二抗溶液
- 在含有10% NGS的抗体缓冲液中，按1:1000比例稀释二抗，配制二抗溶液。重要提示：将二抗稀释液在台式离心机中以最大速度离心5分钟，以去除沉淀的抗体。省略此步骤会导致二抗背景信号升高。
未转染细胞：在无细胞标记的情况下，分别使用Alexa-594和Alexa-488标记的二抗对突触前和突触后标志物进行标记。例如，我们使用山羊抗兔IgG-Alexa594标记抗synapsin抗体，使用山羊抗小鼠IgG-Alexa-488标记抗homer抗体。重要提示：对于信号较弱的一抗，应选用Alexa-488标记的二抗。
转染细胞：选择与荧光细胞标记物的激发-发射光谱相匹配的二抗。例如，当使用tdTomato标记转染细胞时，我们采用Alexa-647标记的山羊抗兔二抗识别抗synapsin抗体，同时使用Alexa-488标记的山羊抗小鼠二抗识别抗homer抗体。此外，本实验中使用NGS是由于我们所选用的二抗为山羊来源。 - 每孔加入200 μl二抗溶液。
- 在室温避光条件下孵育2小时后，用PBS漂洗3至4次。
5. 盖玻片封片
- 将盖玻片用含DAPI的Vectashield封片剂（Vector Laboratories Inc.，货号：H-1200）封固于载玻片（VWR scientific，货号：48311-703）上。
- 在盖玻片边缘轻轻涂抹透明指甲油，并置于干燥、避光处静置至少30分钟使其干燥。重要提示：涂抹指甲油时避免触碰或移动盖玻片，否则会导致细胞剪切损伤。
6. 成像
进行成像时，需要配备能够同时采集4个不同通道图像的相机的荧光显微镜，以便对突触标记物、细胞填充物以及细胞核（DAPI/可选）进行成像。应使用63倍油浸物镜对细胞进行成像。我们采用蔡司AxioImager荧光显微镜，配备蔡司Plan-APOCHROMAT 63x/1.4 Oil DIC ∞/0.17物镜进行成像。
- 选择距离最近邻细胞至少两个细胞直径以上的细胞。若需观察未转染的细胞以避免选择偏差并确保细胞选择的随机性，应在 DAPI 通道中选择细胞，然后在所有通道中采集图像。若观察转染细胞，则应在对应荧光标记的通道中选择细胞（例如 tdTomato），以识别转染细胞。
- 采集图像：
未转染细胞：对每个选定的细胞，获取 GFP 和 Texas Red 通道的 8 位图像。叠加后的伪彩图像中，突触前和突触后标记物应分别为红色和绿色。
转染细胞：对每个选定的细胞，获取 GFP、Texas Red 和 Cy5（或 Cy5.5）通道的 8 位图像。叠加后的伪彩图像中，突触前和突触后标记物应分别为红色和绿色，细胞填充物伪彩为蓝色。
7. 图像分析与共定位点状结构定量
- 我们使用 Puncta Analyzer 程序来定量共定位的突触斑点。Puncta Analyzer 插件由 Bary Wark 编写，可通过申请获取（c.eroglu@cellbio.duke.edu）。Puncta Analyzer 可在 ImageJ 1.26 版本中运行（http://rsbweb.nih.gov/ij/，更高版本的 ImageJ 无法运行该程序）。安装 Puncta Analyzer 时，只需将下载的应用程序文件夹放入 ImageJ 1.26 目录下的“Plugins”文件夹中即可。
- 使用 ImageJ 打开其中一幅图像。利用 ImageJ 菜单中的选择工具确定感兴趣区域（ROI）。我们通常使用圆形选择工具，在目标细胞体周围径向选择约一个细胞直径大小的区域。
- 选定感兴趣区域（ROI）后，进入插件菜单并选择“Puncta Analyzer”。
- 在弹出的“分析选项”窗口中，选择“红色通道”、“绿色通道”、“减去背景”中的第一项以及“设置结果文件……”。点击“确定”。系统将提示您定义结果的保存位置。这些结果可导出至 Excel 进行进一步分析。
- 在接下来出现的窗口中，确保选择滚动球半径为 50，并取消勾选“白色背景”选项（此修改非必需，但通常用户为便于可视化而偏好此设置）。点击“确定”。
- 随后将出现一个新窗口及与红色通道图像对应的掩膜。调整阈值，直到您认为红色掩膜尽可能准确地覆盖了各个独立的斑点，同时避免引入过多噪声。这是本实验方案中最主观的步骤之一，因此请务必建立一致的操作方法。点击“完成”。将最小斑点大小设为 4 像素，其余参数保持不变。点击“确定”。
- 重复上一步操作，但此次针对绿色通道进行。
- 完成上述步骤后，插件将提供各通道中斑点的定量结果，以及两个通道间共定位斑点的定量数据。
脑切片：
突触检测法可应用于脑组织的冷冻切片，以及任何其他神经系统组织（如脊髓或视网膜），前提是存在合适的突触前和突触后标记物组合（具有在切片中效果良好的抗体），可用于识别需要定量的突触。该突触检测法能够揭示特定脑区突触形成的时序调控，并可定量分析转基因动物或经其他方式处理的样本中突触连接性的变化效应。
1. 小鼠脑组织的采集
所有动物实验操作均应遵循 IACUC 动物实验方案。
- 通过放血并用 PBS 灌注处死小鼠。PBS 灌注对于去除血液至关重要，可降低染色过程中的背景信号。重要提示：切勿使用 4% PFA 等固定剂进行灌注，这将对染色结果产生不利影响。
2. 固定
- 在4% PFA的PBS溶液中于4°C条件下固定整个脑组织过夜。次日，用PBS缓冲液将脑组织清洗3次。
- 将脑组织置于含30%蔗糖的PBS溶液中进行冷冻保护。组织最初会漂浮。保持在4°C直至组织沉至底部，此时冷冻保护完成。
3. 包埋/冷冻切片
- 将脑组织以所需方向（例如矢状面或冠状面）包埋于 PBS 中按 2:1 比例配制的 30% 蔗糖:OCT（Tissue-Tek，货号：4583）溶液中。将包埋好的脑组织在干冰的平面上冷冻。冷冻后的包埋脑组织可置于冷冻袋中，在 -80°C 下保存长达一年，之后进行切片。
- 将组织以 12–16 μm 厚度进行冷冻切片，并贴附于载玻片（Sigma，货号：S4651）上。切片后的载玻片可在染色前于 -80°C 保存最多一周。
- 待染色的载玻片应在 37°C 下干燥 30 分钟，并用 PBS 漂洗 1 次，以去除残留的 OCT 包埋剂。
4. 封闭切片
- 在室温下用含20%正常山羊血清（NGS）的PBS封闭切片，持续一小时。重要提示：此步骤中切勿加入Triton X-100。在加入封闭液之前，可使用Elite PAP Pen（DBS，货号：K039）在载玻片上的切片周围创建疏水屏障
5. 应用一抗
- 将一抗用含0.3% Triton和10% NGS的PBS稀释。
- 在脑切片中，我们使用PSD-95（Zymed，Rabbit，1:500）标记谷氨酸能突触后区室，使用VGlut1或VGlut2（Chemicon，guinea pig，1:2500）标记谷氨酸能突触前终末。若存在沉淀，将一抗稀释液在台式离心机中以最大速度离心5分钟，以去除沉淀的抗体。
- 将切片在4°C下于一抗溶液中孵育36–60小时。
6. 加入二抗
- 通过将切片浸入 PBS 中清洗 3 次，每次 15 分钟，以去除未结合的一抗。此步骤完成后，务必避免切片暴露于直射光线下。
- 将二抗按 1:200 的比例用与一抗相同的缓冲液稀释。例如，对于 VGlut/PSD95 染色，我们使用 goat anti guinea-pig Alexa 488（Vglut）和 goat anti rabbit Alexa 594（PSD-95）（Invitrogen）。
- 将组织切片置于二抗溶液中，室温避光孵育 2 小时。
- 通过将切片浸入 PBS 中清洗 4 次，每次 15 分钟，以去除未结合的二抗。
7. 封片
- 在载玻片（VWR scientific）上滴加少量含DAPI的Vectashield封片剂（Vector Laboratories Inc.），然后盖上盖玻片（VWR Scientific, No. 1.5, 48393 241）。用指甲油固定盖玻片，防止其移动。
8. 成像
重要提示：此处所述成像需要至少具备3个通道的共聚焦显微镜。我们使用徕卡SP5激光扫描共聚焦显微镜，配备63倍油浸物镜进行成像。
- 应在各切片之间一致地选择要扫描的突触脑区。例如，在我们对视网膜神经节细胞（RGC）突触投射至上丘神经元的突触检测中，我们对邻近下丘的上丘外侧区域进行成像，该区域包含接收视网膜-上丘轴突投射的突触层7,8,9。我们对上丘上部150 μm的突触区进行成像和定量分析，该区域已知是RGC建立突触连接的部位9。
- 对于每个切片，在488和594通道中，我们以0.33 μm的间隔连续采集共5 μm深度的光学切片，总计获得15个光学切片。每只动物至少需成像3个切片，并且每种实验条件下至少需包含3只动物。
- 将连续3个光学切片组成一组，生成最大强度投影图像（MIP），共得到5个MIP，每个代表1 μm的深度。这些MIP用于后续定量分析。
9. 图像定量分析
- 可完全按照视网膜神经节细胞（RGCs）的方法进行操作，但感兴趣区域（ROI）的形状和大小将根据您希望定量的图像区域而变化。
成功的要点：
纯化的RGCs：
- 在固定纯化的RGC（或其它解离培养物）之前，务必在37°C水浴中预热4% PFA约20-25分钟（其余时间均储存于4°C，PFA稀释液使用不得超过7天）。
- 对于培养的神经元，建议在所有洗涤步骤中避免使用真空抽吸装置。采用巴斯德移液管配合吸球等更温和的方法，可显著提高染色质量。
- 在洗涤步骤中需注意防止细胞干燥。
- 涂抹指甲油时避免触碰或移动盖玻片，否则可能导致盖玻片上的细胞发生剪切损伤。
- 所有一抗和二抗使用前均需离心，以去除可能形成沉淀的抗体，避免对染色造成不利影响。
- 务必选择由不同物种产生的用于突触前和突触后标记物的一抗。若未如此选择，将无法在使用二抗后区分两种信号。
脑切片：
- 不要用PFA等固定剂对小鼠进行灌注。
- 脑切片的封闭液中不要加入Triton-X 100。这样做会损害突触前标志物的染色质量，尤其是与突触小泡相关的突触前标志物。
- 必须使用共聚焦显微镜进行成像，以获得足够高质量的图像用于突触分析。
代表性结果：
上述突触检测方法旨在捕捉突触连接性的变化 体外 和 体内在我们的实验室中，我们利用突触检测实验来确定单个或多种星形胶质细胞分泌分子对突触形成的影响。我们通常在纯化的视网膜神经节细胞（RGCs）上进行此类突触检测实验，这些细胞是我们培养的 体外.
在纯化的视网膜神经节细胞（RGC）培养物中，长期应用星形胶质细胞条件培养基（ACM）的一个已被充分描述的效应是RGC之间形成的突触数量显著增加数倍3,4,5,6。图1A和1B展示了未经转染的纯化RGC分别用基础生长培养基或ACM处理后的代表性图像。在对兴奋性突触前和突触后标志物进行染色后，ACM诱导的突触形成增加在定性上清晰可见（图1A，1B）。事实上，这一发现已得到多项研究的证实：通过电生理学实验表明，ACM诱导形成的突触具有功能活性；通过电子显微镜观察表明，这些突触的超微结构正常3,4,6。我们实验室的其他研究已鉴定出钙通道亚基α2δ-1是星形胶质细胞分泌的一种强效促突触生成分子——血小板反应蛋白（thrombospondin）的神经元受体3。本文还包括了一项在纯化RGC中进行的实验结果，旨在确定α2δ-1水平的升高是否能进一步增强ACM诱导的突触形成（图3）。
视网膜神经节细胞在5天后共转染空载体或编码α2δ-1的质粒，同时转染编码tdTomato的独立质粒 体外 （DIV5）。在分别用ACM或GM进行慢性处理后，于DIV 11固定并染色RGCs。通过标记兴奋性突触的突触前和突触后标志物，我们定性观察到，在表达空载体（pcDNA3.1）或α2δ-1的纯化RGCs中，突触数量明显增加（图1C，1D）。我们使用Puncta Analyzer对每种条件下至少15个神经元的突触数量进行定量分析以评估ACM的促突触生成效应（图2）。该样本量足以计算每个神经元的平均突触数量，并发现经ACM处理且表达空载体的神经元其突触数量显著增加约10倍（图3，灰色柱状图）。此外，我们还显示，α2δ-1的过表达可显著增强ACM诱导的突触形成，增幅约为20倍（图3，黑色柱状图）。
除了培养的神经元外，我们还可以利用该技术定量不同脑区中的突触密度。上丘是一种接受视网膜-上丘投射的脑结构，这种投射起源于视网膜中的视网膜神经节细胞（RGCs）7,8,9。在出生后发育过程中，RGCs 在上丘靶细胞上形成的兴奋性突触数量从 P7 到 P21 期显著增加7,8,9。
利用我们的定量技术，我们发现视网膜-上丘突触在上丘中的数量从出生后第7天（P7）到第14天（P14）有所增加。为此，我们在P7和P14两个时间点分别定量了突触密度。我们对上丘组织进行染色，标记PSD-95（突触后标记物）和VGlut2（在上丘中特异性标记视网膜神经节细胞突触的突触前标记物）。对上丘的外层突触区域进行成像（图4A），并对VGlut2与PSD-95共定位的突触进行定量（图4B、4C），每只动物至少分析3个切片，每个时间点至少分析3只动物。对所得数据的定量分析明确显示，从P7到P14，突触数量显著增加了三倍以上。这些结果与先前使用电子显微镜的研究结果一致9（图4D）。
总之，本文所述的突触数量定量方法是一种有效的工具，可用于测定培养物及神经组织中的突触数量与密度，从而帮助我们研究调控突触形成所产生的影响。 体外 或 体内.
图1：纯化RGCs中典型的突触染色。（A和B） 3天 体外 （DIV）将RGCs在（A）基础生长培养基（GM）或（B）促突触生成的小鼠星形胶质细胞条件培养基（ACM）中继续培养6天。随后对细胞进行bassoon（突触前，红色）和homer（突触后，绿色）免疫标记。小鼠ACM显著促进RGCs之间的突触形成，表现为共定位的bassoon与homer斑点数量明显增加。（C和D）5DIV的RGCs转染了过表达钙通道亚基α2δ-1的质粒。转染细胞通过tdTomato细胞填充（蓝色）进行识别，并对突触前标志物synapsin和突触后标志物homer进行染色。箭头指示突触位置。比例尺表示 20 μm.
图2：使用Puncta Analyzer定量突触数量。 图中显示了一个示例：(a) 过表达血小板反应蛋白受体α2δ-1的纯化视网膜神经节细胞的原始图像，该细胞经突触前标志物synapsin和突触后标志物homer染色；(b) 在Puncta Analyzer中分析荧光点时，各通道生成的对应掩膜图像；(c) Puncta Analyzer将生成如图所示的图像，其中荧光点以小黑点表示（插图）；此外还显示了(d) 该应用程序的数值输出结果，以文本/数字形式提供荧光点数量及其他多个参数（加粗文本为强调）。
图 3：突触形成实验的代表性结果。 图中显示在转染了空载体（pcDNA3.1，灰色柱）或血小板反应蛋白受体 α2δ-1 的视网膜神经节细胞（RGCs）中，星形胶质细胞条件培养基（ACM）长期处理对突触生成的影响。误差线表示标准误（SEM）。GM = 生长培养基。ACM = （大鼠）星形胶质细胞条件培养基。
图4：小鼠上丘突触密度的定量分析。（a）为了确定视网膜神经节细胞（RGCs）在啮齿类动物脑内向上丘靶区建立的谷氨酸能突触数量在发育过程中的变化，我们使用针对突触前标志物VGlut2（绿色）和突触后标志物PSD-95（红色）的抗体对小鼠脑组织的冷冻切片进行染色。我们利用激光扫描共聚焦显微镜对小鼠上丘（SC）外侧150 × 150 μm区域（对应RGCs的突触靶区）进行成像。对每个SC切片采集z轴堆栈图像，总深度为5 μm（15个0.33 μm的光学切片）。将每3个连续的光学切片生成最大强度投影图像（MIP），每个切片共生成5个MIP，每个MIP代表1 μm的深度。下方显示的是来自P14野生型小鼠上丘的一个代表性MIP图像。突触前标志物VGlut2以绿色显示，突触后标志物PSD-95以红色显示。（c）Puncta Analyzer软件生成的数值结果。（d）对每只动物至少3个切片进行突触数量分析的定量结果，每个时间点使用3只动物（误差棒表示标准误SEM）。比例尺为50 μm。
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讨论
上述突触检测方法基于我们的实验目标，主要关注视网膜神经节细胞（RGCs）的兴奋性投射，无论是在纯化培养中还是在脑切片中。我们提供了一个参考表格，列出了适用于标记兴奋性突触且效果良好的抗体（表1）。
该突触检测方法可进行调整，用于量化任何神经元群体或任何其他突触亚型的突触数量，前提是存在特异性的突触前和突触后标记物。例如，通过选用适当的突触前和突触后标记物，此处所述的突触检测方法可用于研究GABA能（而非谷氨酸能）突触10,11。
该突触检测方法是研究神经元之间突触连接变化的重要工具。尽管有必要通过电子显微镜和电生理学技术来验证本检测的结果，但它仍为回答有关调控神经元形成突触能力的分子信号的重要问题提供了相对简便的方法。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
Image J 的 Puncta Analyzer 插件由 Barry Wark（现任职单位：Physion Consulting）在 Ben A. Barres（斯坦福大学）实验室编写。
资金；
- 艾尔弗·斯隆基金会
- 艾斯特·A·和约瑟夫·克林斯坦基金公司
- 布罗德生物医学研究基金会
- 亨廷顿病治疗倡议
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 突触前 | Synapsin | 兔 | 多克隆 |
| Synapsin | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Bassoon | 小鼠 | 单克隆 | Assay Designs |
| Bassoon | 豚鼠 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | 兔 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| VGlut1 | 小鼠 | 单克隆 | Millipore |
| VGlut1 | 豚鼠 | 多克隆 | Millipore |
| VGlut2 | 豚鼠 | 多克隆 | Millipore |
| 突触后 | PSD-95 (6G6-1C9 克隆) | 小鼠 | 单克隆 |
| PSD-95 | 兔 | 多克隆 | Zymed |
| Homer | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Homer | 大鼠 | 多克隆 | Millipore |
| Gephyrin | 兔 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Gephyrin | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| 表1： 列出了我们在突触检测中成功使用的一些良好的突触前和突触后标记物示例。请注意，此列表并未穷尽所有可用标记物。Y = 是，N = 否，N.D. = 未确定。 | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| 层粘连蛋白 | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| 正常山羊血清 | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| 含DAPI的VectaShield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA 溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| 颗粒状 PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24孔培养板 | Falcon BD | 35-3047 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa 荧光标记抗体 | Invitrogen | --- | |
| 12 mm，0号玻璃盖玻片 | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| 1.5号玻璃盖玻片（用于脑片） | VWR international | 48393241 | |
| 载玻片 | VWR international | 48311-703 |
参考文献
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
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