本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。
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摘要
摘要
神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，开发出客观的方法来量化突触连接的变化已成为当务之急。本实验方案从样本固定开始，详细描述了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物以及脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记出突触前终末以及突触后特化结构的位点。我们将突触定义为这些标记物所产生的信号之间共定位的点。这些共定位点的数量通过ImageJ分析软件平台下的Puncta Analyzer插件（由Bary Wark编写，可应要求获取，c.eroglu@cellbio.duke.edu）进行量化。本方案中描述的突触检测方法可应用于任何具有选择性突触前和突触后标记物的神经组织或培养样本。该突触检测技术是一种有价值的工具，可在突触发育研究中广泛使用。
方案
需准备的溶液：
- 抗体缓冲液：
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No: BP152-5, 50 mM) - 1.21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat. No: A2153, 1%) - 2.0 g
- 100 mM L-lysine (Sigma, Cat. No: L-1137, 100 mM) - 3.65 g
- 调节 pH 至 7.4
- 0.04% 叠氮化钠
- 用蒸馏 H2O 定容至 200 ml。
- 用 0.22μm 滤器过滤（Millipore, Cat. No: SCGPU02RE）。
- PFA 稀释液：
- 168 ml 0.5 M Na2HPO4（碱性）
- 72 m....
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讨论
上述突触检测方法基于我们的实验目标，主要关注视网膜神经节细胞（RGCs）的兴奋性投射，无论是在纯化培养中还是在脑切片中。我们提供了一个参考表格，列出了适用于标记兴奋性突触且效果良好的抗体（表1）。
该突触检测方法可进行调整，用于量化任何神经元群体或任何其他突触亚型的突触数量，前提是存在特异性的突触前和突触后标记物。例如，通过选用适当的突触前和突触后标记物，此处所述的突触检测方法可用于研究GABA能（而非谷氨酸能）突触10,11。
该突触检测方法是研究神经元之间突触连接变化的重要工具。尽管有必要通过电子显微镜和电生理学技术来验证本检测的结果，但它仍为回答有关调控神经元形成突触能力的分子信号的重要问题提供了相对简便的方法。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
Image J 的 Puncta Analyzer 插件由 Barry Wark（现任职单位：Physion Consulting）在 Ben A. Barres（斯坦福大学）实验室编写。
资金；
- 艾尔弗·斯隆基金会
- 艾斯特·A·和约瑟夫·克林斯坦基金公司
- 布罗德生物医学研究基金会
- 亨廷顿病治疗倡议
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 突触前 | Synapsin | 兔 | 多克隆 |
| Synapsin | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Bassoon | 小鼠 | 单克隆 | Assay Designs |
| Bassoon | 豚鼠 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | 兔 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| VGlut1 | 小鼠 | 单克隆 | Millipore |
| VGlut1 | 豚鼠 | 多克隆 | Millipore |
| VGlut2 | 豚鼠 | 多克隆 | Millipore |
| 突触后 | PSD-95 (6G6-1C9 克隆) | 小鼠 | 单克隆 |
| PSD-95 | 兔 | 多克隆 | Zymed |
| Homer | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| Homer | 大鼠 | 多克隆 | Millipore |
| Gephyrin | 兔 | 多克隆 | Synaptic Systems |
| Gephyrin | 小鼠 | 单克隆 | Synaptic Systems |
| 表1： 列出了我们在突触检测中成功使用的一些良好的突触前和突触后标记物示例。请注意，此列表并未穷尽所有可用标记物。Y = 是，N = 否，N.D. = 未确定。 | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| 层粘连蛋白 | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| 正常山羊血清 | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| 含DAPI的VectaShield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA 溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| 颗粒状 PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24孔培养板 | Falcon BD | 35-3047 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa 荧光标记抗体 | Invitrogen | --- | |
| 12 mm，0号玻璃盖玻片 | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| 1.5号玻璃盖玻片（用于脑片） | VWR international | 48393241 | |
| 载玻片 | VWR international | 48311-703 |
参考文献
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A.
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