用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

摘要

本视频展示了一种在受控环境下研究好氧真菌降解木质纤维素植物组织的方法。琼脂块微环境系统能够控制营养来源和湿度，这是其主要优势，但该方法常出现结果不一致的问题。本文针对关键的实验陷阱进行探讨，以获得可重复、变异度低的实验结果。

摘要

研究真菌降解木质纤维素植物组织的两种主要方法最初是为木材防腐剂测试而开发的（土块法；琼脂块法）。普遍认为，土块法微宇宙系统能产生更高的降解速率，水分问题更少，不同研究间的变异性更低，且对防腐剂毒性的耐受阈值更高。因此，土块法是更常用的技术，并已被美国材料与试验协会（ASTM）标准化（方法 D 1413-07）。然而，土块法设计存在缺点，例如使用具有地域差异的土壤来源，以及难以控制降解组织外部（外源性）的营养条件。这些缺点在将该方法应用于其他日益热门的研究目标时日益凸显。这些现代研究目标包括：为生物能源研究降解木质纤维素材料、测试共代谢有毒物质的生物修复、评估氧化机制，以及追踪沿菌丝网络转移的元素。土块法在这些应用中无法提供足够的控制能力，因此有必要采用一种改进的琼脂块方法。

本研究采用褐腐木材降解真菌Serpula lacrymans，在低钙琼脂块微宇宙系统中降解木材，使用深型培养皿和低钙琼脂。我们通过时间序列实验检测外源石膏对木材降解的影响，以展示该方法的实用性及预期的变异性。取自同一块木材纵向切割条的样品经调湿、称重、高压灭菌后，无菌地放置于塑料网格上方。真菌接种于每个木块的各个表面，外源石膏则添加在界面处。收获过程保持无菌操作，直至最终的破坏性取样。这些微宇宙系统的设计旨在避免木块与琼脂或培养皿壁接触。在倒平板和培养过程中尽量减少冷凝水的产生。此外，接种物、石膏与木材之间的间距尽可能小，但不发生直接接触。琼脂块实验设计中这些看似技术性较低的环节，恰恰是实验失败最常见的原因，也是不同研究之间变异性的主要来源。因此，视频发表在此类研究中具有重要价值，本文展示了低变异性和高质量的实验结果。

方案

本方案适用于木质和非木质基质，如文中所述，也适用于烘箱干燥或空气干燥的材料。但在设置前，请先通读整个方案。文中提出了若干可能影响您研究的要点，这些要点（已加下划线）需要提前规划。此外，请注意目前有两种已发表的琼脂块方法偶尔被使用：一种是英国标准838（British Standard 838），另一种是遵循Bravery（1978年）提交给国际木材保护研究组织（IRG-WP）的论文所描述的方法。我们的方法与838标准相似，主要在微环境设计和琼脂培养基控制方面进行了修改。然而，由于历史上木材样品块的水分控制存在问题，可能导致缺氧和实验结果变异，这两种方法通常都被避免使用。关于这些测试方法的综述，包括对琼脂块设计（含838标准）的讨论，可参见Nicholas（1973年）的文献。

1) 准备微宇宙系统

这些试验所用的微型培养皿比普通培养皿高1 cm（更深），以增加木块上方的空间。培养皿中加入适量且精确量的琼脂，以控制营养物的绝对含量及其浓度，并确保木块与皿盖之间保持足够距离（>3 mm）。在石膏测试中使用的琼脂为低钙型A类琼脂；然而，本研究展示的结果采用布莱克斯利培养基（Blakeslee's medium），这是美国典型培养物保藏中心（ATCC）推荐用于维持测试菌株Serpula lacrymans（Wulfen: Fries）Schroeter菌株EMPA 65（ATCC 32750）的培养基。

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讨论

利用我们的琼脂块实验装置（图1），Serpula lacrymans 能够直接与石膏表面接触生长，并侵入木材块中（图2），导致对照组褐腐松木块的重量损失超过60%（图3）。该结果轻松满足ASTM标准中>50%的腐朽要求，且在第16周时腐朽程度的平均变异系数（C_V）为0.055。此数据已发表于Schilling⁷的研究中。需要注意的是，其他真菌在琼脂块中的培养时间通常需长于土壤块中的培养时间。作为参考，我们在以往的多个实验中已成功应用类似设计，研究了多种其他真菌种类，并常结合扫描电子显微镜-能谱分析（SEM-EDS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）来验证真菌与外源基质的连接性，以及钙和其他元素向木材内部的迁移^8,9。

除了变异性较低之外，我们的琼脂块设计还揭示了另外两个结果。首先，存在处理效应（图3），即无论以CaCl₂形式还是纯石膏形式向琼脂中添加钙，均会抑制该真菌的降解作用。这一结果具有重要意义，因为其他研究者曾基于对砂浆和灰泥等实际材料的研究，提出钙可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿	Nalge Nunc international	4014	25 × 150 mm
琼脂，A型	Sigma-Aldrich	A4550
硝酸铵，NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
磷酸二氢钾，KH2PO4	JT Baker	3246-01
七水合硫酸镁，MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	右旋糖
硼酸，H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
七水合硫酸锌，ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
四水合氯化锰，MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
五水合硫酸铜(II)，CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
四水合钼酸铵，(NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
二水合氯化钙，CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
氯化钠，NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
七水合硫酸亚铁，FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
移液辅助器	Drummond Scientific	4-000-110	无线 用乙醇擦拭表面
10 ml 无菌聚苯乙烯移液管	BD Biosciences	357551
滤网盖	Thermwell Products Co.	VX620	预先用肥皂清洗 五金店
半水合硫酸钙，CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
4号软木钻孔器	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996