我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida albicans生物膜的简单、快速且稳健的方法，并阐述其在检测生物膜内细胞抗真菌药物敏感性中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
白色念珠菌 仍然是不断扩大的免疫功能低下患者群体中真菌感染最常见的病因，而念珠菌病现已成为美国医院内第三大常见感染。念珠菌病的不同临床表现均与生物膜的形成有关，无论是在宿主组织上和/或医疗器械（如导管）上。生物膜的形成具有不良的临床后果，因为生物膜内的细胞可免受宿主免疫反应以及抗真菌药物的作用。我们已开发出一种简单、快速且稳健的 体外 形成模型 C. albicans 使用96孔微孔板进行生物膜培养，该方法也可用于生物膜抗真菌药物敏感性检测。本实验采用比色法读数，其原理基于代谢活跃的真菌生物膜细胞还原XTT（一种四唑盐）。典型的实验流程包括约24小时的生物膜形成阶段，随后进行约24小时的抗真菌药物敏感性检测。由于该方法操作简便，且仅需常规实验室材料与设备，因而降低了生物膜研究的技术门槛，是实现真菌生物膜抗真菌药物敏感性检测标准化的重要一步。
方案
1. 准备 C. albicans
C. albicans 属于危险等级1级/生物安全等级1级微生物。在操作该微生物时，务必始终采用良好的无菌技术，并遵循所在机构关于生物危害材料正确处置的规程。
- 制备过夜培养物 C. albicans YPD（酵母膏蛋白胨葡萄糖）液体培养基中，接种单个菌落 C. albicans 加入 25 mL YPD 中。
- 在摇床（约180 rpm）中孵育培养物 30 °C 过夜。大多数 C. albicans 在这些条件下，菌株将作为酵母细胞生长。
- 离心过夜培养物（约 3,000 rpm，5–10 分钟），用无菌 PBS 洗涤细胞两次，将最终沉淀重悬于约 20–25 mL RPMI 1640 培养基中，该培养基用 165 mM 吗啉丙磺酸缓冲至 pH 7.0，并预热至 37 °C （此后该培养基简称为“RPMI 1640”）
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。计数后，制备细胞悬液，使细胞终浓度为 1.0 x 106 细胞/mL，RPMI 1640培养基
注意：由于细胞容易发生聚集，在每次洗涤之间以及移液前必须充分涡旋振荡。
2. 设置96孔微孔板以形成生物膜
- 使用多通道移液器将 100 μL 的 C. albicans 悬液加入 96 孔微孔板的选定孔中。不要向第 12 列的孔中加入细胞，这些孔将作为阴性对照。
- 用微孔板的原始盖子盖好整个板，用封口膜密封后放入培养箱，在 37 °C 下孵育 24 小时。孵育时间可根据具体实验设计进行调整。例如，可通过接种多个微孔板并在不同时间点（即 2、4、8、12、24 和 48 小时）分别处理各板，来检测生物膜形成的动力学过程，时间范围可为 24–48 小时。
- 生物膜形成后，使用多通道移液器小心吸出培养基，注意不要触碰或破坏各孔中已形成的生物膜。
- 使用多通道移液器用无菌 PBS 洗涤微孔板三次（每孔 200 μL）。也可使用自动微孔板洗板机进行洗涤。每次洗涤之间，尤其是最后一次洗涤后，应将微孔板倒置，用纸巾轻压以吸除残留的 PBS。此时，各孔底部形成的生物膜即使肉眼也可清晰观察到，也可使用倒置显微镜进行观察（图 1）。生物膜现已准备好用于抗真菌药物敏感性检测实验。
（若实验主要目的是评估生物膜形成的程度，则可直接采用比色法处理微孔板。此时可加入 XTT/甲萘醌试剂（见下文步骤 3），并使用微孔板读数仪测定所产生的颜色信号）。
3. 生物膜抗真菌药物敏感性试验
- 从储备液或粉末开始，用RPMI 1640培养基配制待测抗真菌药物的工作液。氟康唑的典型高浓度为1,024 μg/mL，两性霉素B和卡泊芬净的典型高浓度均为16 μg/mL。其他药物可使用不同的浓度。
- 使用多通道移液器，将200 μL抗真菌药物的高浓度工作液加入含有真菌生物膜的每块微量滴定板第1列的相应孔中。
- 向第2至第10列的每个孔中加入100 μL RPMI 1640培养基。
- 向第11列的孔中加入100 μL RPMI 1640培养基。
- 从第1列各孔中取出100 μL抗真菌药物溶液，加入相邻的第2列孔中（该孔已含有100 μL培养基）。
- 通过反复吹打充分混匀内容物，完成连续倍比稀释，并更换移液器吸头。
- 重复上述操作向右进行，直至第10列；混合后，将第10列各孔中的最后100 μL溶液弃去。由此即得到一系列倍比稀释的待测药物溶液，浓度从第1列孔中的最高浓度递减至第10列孔中的最低浓度。第11列中未加药物的生物膜作为阳性对照，第12列的空孔作为阴性对照。
- 盖上培养板盖，用Parafilm封口膜密封，并在37 °C条件下孵育24–48小时。
- 孵育结束后，按照步骤2.4的方法用PBS洗涤培养板（3次）。
- 使用多通道移液器，向每个含有预洗生物膜的孔以及阴性对照孔中加入100 μL XTT/甲萘醌溶液，用于测定背景XTT比色值。
- XTT需配制成在无菌乳酸林格液、PBS或生理盐水中浓度为0.5 g/L的饱和溶液，并使用0.22 μm孔径滤器过滤除菌。XTT溶液对光敏感，配制过程中应使用铝箔避光。配制并过滤除菌后，分装为每管10 mL的工作体积，于-70 °C保存。储存时使用铝箔包裹管子以避光。仅在实验前根据需要解冻相应数量的分装管。
- 甲萘醌需配制成10 mM的储备液，溶剂为100%丙酮，分装为约50 μL的小体积，于-70 °C保存。使用前临时配制XTT/甲萘醌工作液：将1 μL甲萘醌储备液加入含有10 mL已解冻XTT溶液的试管中。
- 用铝箔包裹培养板，于37 °C避光孵育2小时。
- 取下铝箔。使用多通道移液器从每个孔中吸取80 μL显色后的上清液，转移至新的微量滴定板的相应孔中。
- 使用微量滴定板读数仪在490 nm波长下读取吸光度值。
- 计算最低抑制浓度SMIC50和SMIC80，即与未加抗真菌药物的对照生物膜（本实验中为第11列的数值）相比，比色读数分别降低50%或80%时的抗真菌药物浓度（注意：还需从实验孔读数中减去仅含XTT的阴性对照孔，即第12列孔的读数）。SMIC结果可以以表格形式呈现（例如多种分离株对多种抗真菌药物的结果），也可针对每种真菌分离株与每种抗真菌药物的组合，通过绘制抑制率对药物浓度的曲线图来展示结果。
示例： 扣除阴性对照的数值后，第11列中对照生物膜的平均吸光度（O.D.）为1.32。SMIC50是指能够引起 > 比色读数降低50%时的浓度，在本例中为小于1.32 × 50/100 = 0.66。同理，SMIC80是指引起最低抗真菌浓度 > 比色读数减少80%，在此情况下小于1.32 × 20/100 = 0.264。
4. 代表性结果
图1显示了一张显微照片 C. albicans 在96孔微孔板的孔底形成的生物膜，使用倒置显微镜拍摄。图2显示XTT比色法读数（OD490 每个11种生物膜的值） C. albicans 野生型菌株在同一个96孔微孔板的8个不同行中形成。图3显示了两性霉素B在不同浓度下对 C. albicans 生物膜；箭头指示 SMIC50 和 SMIC80 值。
图1.(A) 图A显示了使用倒置显微镜连接相机拍摄的白色念珠菌（C. albicans）生物膜的显微照片，该生物膜形成于孔板底部，在吸除RPMI培养基并用PBS洗涤后获得。(B) 采用扫描电子显微镜观察的典型白色念珠菌（C. albicans）生物膜的显微图像。图A和图B的比例尺分别为100 μm和10 μm。
图2. 多个等效物的形成 C. albicans 96孔微孔板中的生物膜 比色读数（OD490 XTT还原实验测得的生物膜形成值 C. albicans 野生型在微量滴定板孔中的生物膜形成情况。数据来自同一块96孔微量滴定板中8个不同行各自独立形成的11个生物膜。采用单因素方差分析对不同行的结果进行比较，并结合Bartlett's方差齐性检验和Bonferroni多重比较事后检验。在对所有行两两比较时，未发现具有统计学意义的显著差异（P < 0.05）。 > 0.05).
图3. 针对真菌的抗真菌药物敏感性试验典型结果 C. albicans 生物膜 不同浓度两性霉素B对生物膜抑制效果的典型结果图 C. albicans 野生型菌株。数值表示相对于对照孔的XTT还原实验平均吸光度百分比。SMIC50和SMIC80值由箭头指示。
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讨论
本文介绍一种简单、快速、经济且高度可重复的96孔微孔板模型，用于形成Candida生物膜，并结合XTT比色法检测生物膜内细胞的代谢活性。该96孔微孔板生物膜形成模型最初为C. albicans开发，但也可用于其他Candida spp.，并可轻松适用于其他真菌生物体。该方法可用于考察影响生物膜形成的多种参数和因素，评估多个真菌分离株和/或突变株的生物膜形成能力。但更重要的是，该方法在测定生物膜内细胞的抗真菌药物敏感性方面具有重要应用价值。
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披露
JLL-R 在 MicrobeHTS Technologies, Inc. 持有股权，该公司正在开发抗真菌药物。本研究未获得 MicrobeHTS Technologies, Inc. 的任何资金支持。
致谢
实验室中与生物膜相关的研究工作由美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，资助项目编号为R21DE017294和R21AI080930（授予J.L.L.-R.）。本内容仅由作者负责，不一定代表NIDCR、NIAID或美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 沙氏葡萄糖琼脂 | BD Biosciences | 211584 | 用于真菌分离株新鲜传代培养平板的制备 |
| YPD：酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基 | US Biological | Y2076 | 用于过夜液体培养物增殖的培养基 |
| 不含碳酸氢钠并添加L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 | Cellgro | 50-020-PB | 用于生物膜形成的液体培养基 |
| 吗啉丙磺酸（MOPS） | Fisher Scientific | BP308 | 用于缓冲RPMI 1640培养基 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | 洗涤用缓冲液 |
| XTT钠盐 | Sigma-Aldrich | X4251 | 制备方法见上文 |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | 用于XTT溶液的配制 |
| 甲萘醌 | Sigma-Aldrich | M5625 | 注意：经皮肤接触、吸入或摄入后具有危害性 |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml 圆锥形离心管 | Corning | 430790 | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | Corning | 430828 | |
| 96孔微孔板：聚苯乙烯，平底，组织培养处理 | Corning | 3595 | |
| 多通道移液器及吸头 | Eppendorf | ||
| 培养箱 | Any Supplier | ||
| 微孔板读板仪 | Any Supplier |
参考文献
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