我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida albicans生物膜的简单、快速且稳健的方法，并阐述其在检测生物膜内细胞抗真菌药物敏感性中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
白色念珠菌 仍然是不断扩大的免疫功能低下患者群体中真菌感染最常见的病因，而念珠菌病现已成为美国医院内第三大常见感染。念珠菌病的不同临床表现均与生物膜的形成有关，无论是在宿主组织上和/或医疗器械（如导管）上。生物膜的形成具有不良的临床后果，因为生物膜内的细胞可免受宿主免疫反应以及抗真菌药物的作用。我们已开发出一种简单、快速且稳健的 体外 形成模型 C. albicans 使用96孔微孔板进行生物膜培养，该方法也可用于生物膜抗真菌药物敏感性检测。本实验采用比色法读数，其原理基于代谢活跃的真菌生物膜细胞还原XTT（一种四唑盐）。典型的实验流程包括约24小时的生物膜形成阶段，随后进行约24小时的抗真菌药物敏感性检测。由于该方法操作简便，且仅需常规实验室材料与设备，因而降低了生物膜研究的技术门槛，是实现真菌生物膜抗真菌药物敏感性检测标准化的重要一步。
方案
1. 准备 C. albicans
C. albicans 属于危险等级1级/生物安全等级1级微生物。在操作该微生物时，务必始终采用良好的无菌技术，并遵循所在机构关于生物危害材料正确处置的规程。
- 制备过夜培养物 C. albicans YPD（酵母膏蛋白胨葡萄糖）液体培养基中，接种单个菌落 C. albicans 加入 25 mL YPD 中。
- 在摇床（约180 rpm）中孵育培养物 30 °C 过夜。大多数 C. albicans 在这些条件下，菌株将作为酵母细胞生长。
- 离心过夜培养物（约 3,000 rpm，5–10 分钟），用无菌 PBS 洗涤细胞两次，将最终沉淀重悬于约 20–25 mL RPMI 1640 培养基中，该培养基用 165 mM 吗啉丙磺酸缓冲至 pH 7.0，并预热至 37 °C （此后该培养基简称为“RPMI 1640”）
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。计数后，制备细胞悬液，使细胞终浓度为 1.0 x 106 细胞/mL，RPMI 1640培养基
注意：由于细胞容易发生聚集，在每次洗涤之间以及移液前必须充分涡旋振荡。
2. 设置96孔微孔板以形成生物膜
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讨论
本文介绍一种简单、快速、经济且高度可重复的96孔微孔板模型，用于形成Candida生物膜，并结合XTT比色法检测生物膜内细胞的代谢活性。该96孔微孔板生物膜形成模型最初为C. albicans开发，但也可用于其他Candida spp.，并可轻松适用于其他真菌生物体。该方法可用于考察影响生物膜形成的多种参数和因素，评估多个真菌分离株和/或突变株的生物膜形成能力。但更重要的是，该方法在测定生物膜内细胞的抗真菌药物敏感性方面具有重要应用价值。
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披露
JLL-R 在 MicrobeHTS Technologies, Inc. 持有股权，该公司正在开发抗真菌药物。本研究未获得 MicrobeHTS Technologies, Inc. 的任何资金支持。
致谢
实验室中与生物膜相关的研究工作由美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，资助项目编号为R21DE017294和R21AI080930（授予J.L.L.-R.）。本内容仅由作者负责，不一定代表NIDCR、NIAID或美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 沙氏葡萄糖琼脂 | BD Biosciences | 211584 | 用于真菌分离株新鲜传代培养平板的制备 |
| YPD：酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基 | US Biological | Y2076 | 用于过夜液体培养物增殖的培养基 |
| 不含碳酸氢钠并添加L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 | Cellgro | 50-020-PB | 用于生物膜形成的液体培养基 |
| 吗啉丙磺酸（MOPS） | Fisher Scientific | BP308 | 用于缓冲RPMI 1640培养基 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | 洗涤用缓冲液 |
| XTT钠盐 | Sigma-Aldrich | X4251 | 制备方法见上文 |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | 用于XTT溶液的配制 |
| 甲萘醌 | Sigma-Aldrich | M5625 | 注意：经皮肤接触、吸入或摄入后具有危害性 |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml 圆锥形离心管 | Corning | 430790 | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | Corning | 430828 | |
| 96孔微孔板：聚苯乙烯，平底，组织培养处理 | Corning | 3595 | |
| 多通道移液器及吸头 | Eppendorf | ||
| 培养箱 | Any Supplier | ||
| 微孔板读板仪 | Any Supplier |
参考文献
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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