小鼠的操作性感觉寻求行为

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种利用感觉刺激作为强化物的小鼠操作性学习方法。该方法无需预先训练或食物限制，可在不使用药物或食物等药理学或天然强化物的情况下研究动机行为。

摘要

操作性方法是研究动机行为的有力行为学工具。这些“自我给药”方法由于具有高度的结构效度，已在药物成瘾研究中得到广泛应用。操作性实验为研究人员提供了在临床前水平上探究成瘾过程多个方面的手段。例如，可通过药理学或遗传学工具来检测分子靶点对药物或非药物急性强化机制的影响能力^1-6。此外，还可以在不存在主要强化物的情况下研究药物或食物寻求行为，而药理学化合物干扰该过程的能力则构成了发现可用于成瘾治疗的分子靶点和化合物的临床前模型^3,7-9。在小鼠中进行静脉内药物自我给药研究的一个问题是维持导管通畅的技术难度。此类实验的动物损耗率较高，可达到40%甚至更高^10-15。药物自我给药研究的另一个普遍问题是难以区分强化物所引起的哪些药理学效应导致了特定行为。例如，精神兴奋剂的强化效应和神经生物学效应可能因其精神运动效应而受到干扰。使用食物强化的操作性方法可避免这些缺陷，但其在研究药物成瘾方面的应用受到一定限制，因为某些改变药物自我给药的行为干预对食物自我给药的影响甚微。例如，中脑边缘多巴胺系统损伤或D1多巴胺受体基因敲除会显著降低可卡因的自我给药行为，但对食物自我给药并无显著影响^12,16。

已有研究描述了感觉刺激作为初级强化物（即非条件性强化物）支持操作性反应的能力^17-22。多种物种会自我给予听觉和视觉刺激^18,21,23，然而目前对介导此类强化作用的神经机制仍知之甚少。操作性感觉寻求（OSS）模型是一种在小鼠中实现感觉自我给予的可靠模型，可用于研究感觉强化中重要的神经机制²⁴。OSS的另一个优势在于能够筛选突变小鼠在操作性行为上的差异，这些差异可能与成瘾相关。我们已报道，多巴胺D1受体敲除小鼠——此前已被证明在精神兴奋剂自我给予中存在缺陷——同样无法习得OSS²⁴。这一发现具有独特意义，因为当以食物作为强化物时，这些小鼠仍能学会操作性任务。尽管使用食物强化的操作性研究有助于探讨一般性的动机行为及食物强化的潜在机制，但如上所述，这类研究在用于研究药物成瘾的分子机制方面存在局限性。因此，可能存在介导感觉强化和精神兴奋剂强化的相似神经底物，而这些底物不同于食物强化所依赖的通路，这使得OSS成为研究药物成瘾过程的一个极具吸引力的模型。OSS与其他药物强化物在其他分子靶点上的重叠程度尚不明确，但这是我们目前正在深入研究的课题。虽然OSS模型中可观察到成瘾的某些特征，例如对消退的抵抗性，但我们发现该模型中并不出现摄入量的递增现象²⁵²⁴。有趣的是，在蔗糖自我给予过程中却可观察到摄入量递增及其他一些成瘾特征²⁶。因此，当需要采用非药物操作性程序来研究成瘾相关过程时，可根据具体科学问题选择食物或感觉强化物。

总之，小鼠的食物自我给药和感觉刺激自我给药（OSS）均具有无需植入静脉导管的优点，因而可更高效地研究药理学或遗传学手段干预与动机相关神经靶点所产生的效应。虽然以食物作为强化物的操作式行为测试在研究摄食调节方面特别有用，但OSS特别适用于研究感觉刺激的强化机制，并可能广泛应用于新奇寻求行为和成瘾机制的研究。

方案

1. 编写程序以使用不同的视觉和听觉刺激作为强化物来运行操作性测试实验

1. 固定比率（FR）实验：每次实验持续一小时，实验期间开启室内灯和风扇。渐进比率实验则每次持续两小时。实验全程保持两个杠杆均伸出，并在不同动物间交叉平衡指定“活动”杠杆与“非活动”杠杆（每只动物的杠杆分配始终保持不变）。
2. 编写程序，使每个强化刺激根据以下参数随机变化：
   • 每个强化刺激的持续时间随机选择以下之一：2、4、6 或 8 秒。
   • 每个强化刺激的刺激灯闪烁频率随机选择以下之一：0.625、1.25、2.5 或 5 Hz，占空比均为 50%。
   • 每次刺激灯闪烁随机出现在箱体左侧或右侧。
   • 在强化刺激期间提供听觉刺激；在本实验室中，我们触发输注泵，使其产生的声音强度比箱内背景噪音高约 3 dB。
3. 编写程序以实时显示以下数值：1. 活动杠杆按压次数，2. 非活动杠杆按压次数，3. 强化刺激次数，4. 时间（以 0.1 秒为增量）。

2. 动物处理（3天流程）

1. 在动物进入动物房适应环境后，开始对动物进行抓取操作。这将使动物习惯被拿起和移动的过程。
2. 首先将戴好手套的手放入笼内，静置90秒。如果在此期间并非所有小鼠都已接触或嗅探过手部，则应轻柔地将手移向小鼠，并等待每只小鼠嗅探和/或接触手部后，再进行下一步操作。
3. 逐一小心地抓住每只小鼠尾根部，将其放在手心，迅速提起后轻轻放下，让小鼠自行走回笼内。
4. 根据小鼠的行为表现，重复上述操作5至10次。最后一次操作时，将小鼠抬高（使其站立在手心）并保持一段时间，具体时长根据实验天数而定：第1天保持5秒，第2天10秒，第3天15秒。确保每只小鼠均达到当日的停留时间标准。第1天在不同笼子之间更换手套。
5. 从第2天开始，当小鼠位于手心时，轻抚其背部。同样从第2天起，开始每日称量小鼠体重，并使用记号笔在每只小鼠尾部标记编号以标识个体。
6. 若实验过程中需要进行注射操作，则从第2天开始对小鼠进行注射适应训练。该训练应在笼内所有小鼠均完成当日抓取操作并达到标准后进行。

3. 清洁并测试设备

1. 用热水清洗底部托盘。
2. 使用30%乙醇清洁操作箱的壁面和地面。
3. 运行测试程序，打开主照明灯、风扇和刺激灯，伸出杠杆，并记录杠杆按压。
4. 确保所有灯和风扇正常工作，并测试程序以确认所有杠杆按压均被准确记录。
5. 使用30%乙醇清洁杠杆。

4. 进行操作式条件反射实验（实验应每周进行5-6天，且每天在相同时间进行）

1. 称量每只小鼠的体重。
2. 将程序载入各个实验舱，并对实验进行适当标注。活动杠杆应在不同动物间进行交叉平衡（即一半小鼠的活动杠杆设在左侧，另一半设在右侧），但一旦确定某只小鼠的活动杠杆侧别后，在后续实验中不得更改。
3. 将每只小鼠送入指定的实验舱，关闭舱门，启动实验。
4. 实验结束后，立即取出小鼠并重新标记尾巴。
5. 按照第3节所述方法清洁实验舱。
6. 分析活动杠杆和非活动杠杆按压次数的数据。也可报告强化物数量和/或杠杆准确率（活动杠杆按压百分比）。若需测试某种处理对OSS的影响，需确保所有参与测试的小鼠在开始处理前均已达到习得标准（例如，在最后三次FR-1阶段中，每次活动杠杆按压次数>20次，且活动杠杆按压占比超过65%）。
7. 在完成FR-1反应的习得后，可更改强化程序（例如，采用更高的固定比率、递增比率、随机比率等）。

5. 代表性结果

图1展示了雄性C57Bl/6J小鼠获得OSS的一个示例（改编自文献²³）。对照组小鼠经历了完全相同的实验条件，唯一区别是按压任一杠杆均不会产生任何结果。另一组小鼠的结果如图2所示。在该实验中，一组小鼠接受OSS强化，而另一组接受食物强化。我们发现，在自由进食条件下，OSS强化与10% Ensure食物强化在固定比率和渐进比率反应模式下表现相似（图2，A和B）。这使得我们能够对同一操作在两种不同类型的强化（感觉性强化和食物强化）下的效应进行有效比较，从而避免了因饥饿状态或反应率差异所导致的潜在混杂因素。

图1：OSS小鼠与对照组小鼠的杠杆按压行为。 每次OSS小鼠按压活动杠杆后（强化程序为FR-1），均会接收到不同的视觉和听觉刺激，而按压非活动杠杆则无任何后果。对照组小鼠经历相同实验条件，但按压任一杠杆均无任何后果（杠杆标记为1和2，动物间进行平衡处理的方式与OSS小鼠中活动和非活动杠杆的平衡方式相同）。OSS小鼠对活动杠杆的按压次数显著高于其对非活动杠杆的按压次数（*p<0.05，**p<0.01），也显著高于对照组小鼠在无强化条件下的杠杆按压次数（n=7–8，$p<0.05，$$p<0.01）。该图引自文献²³。

图2：OSS小鼠与对食物产生反应的小鼠的杠杆按压次数。 A.) 小鼠对OSS刺激或食物强化物（10% Ensure）以FR-1强化程序作出反应。所有小鼠均经过 随意摄取 实验期间小鼠可自由获取食物。B）在完成固定比率1（FR-1）阶段后，小鼠进入进展比率（PR）强化程序，持续五天。数据表示每只动物在第四天和第五天的平均值。右侧Y轴显示完成的最终比率，指获得相应强化物所需的操作次数（例如，需完成30次操作以获得10次强化物）。^th 在先前获得九次强化物之后的强化物。

讨论

操作性感觉寻求是当选择小鼠作为实验动物时，静脉药物自我给药的一种有效替代方法。由于该方法无需手术或导管维护，因而具有优势，因为这些在小鼠实验中是重大的技术难题。操作性感觉寻求同样具有吸引力，因为它可能测量的是与其他天然强化物（如食物）不同的强化特征。

值得注意的是，小鼠的行为学测量结果在不同环境条件下可能表现出高度变异性²⁴。我们实验室在开展OSS实验时也遇到了这一问题。在最初建立该实验流程时，动物饲养在一个人员流动频繁、白天始终有大量工作人员活动的设施中。在此期间，小鼠维持在“正常”光照周期下（开灯时间：0600–1800 h；实验时间约为0800–1400）。在迁移到范德堡神经行为学实验室专用的饲养设施后，我们发现OSS的递增比率任务表现明显低于此前观察到的水平；反应行为在五天内持续下降，而非保持稳定。新设施的人员流动较少，且工作人员经过培训，需保持安静并意识到实验对环境敏感性的要求。此后，我们将小鼠调整至一种促进实验时段内清醒状态的光照周期（开灯时间：1500–0300 h；实验时间仍为约0800–1400 h），OSS的表现也随之恢复至我们此前记录的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于小鼠的药物自我给药测试套装：超宽实验箱和可伸缩杠杆	Med Associates, Inc.	MED-307W-CT-D1	杠杆极为灵敏（需约 2 克力），安装位置距箱底 2.2 cm。每个杠杆上方 2 cm 处装有黄色刺激灯。
接口与软件套装	Med Associates, Inc.	MED-SYST-16	此套装适用于最多 16 个实验箱。