全面且经济高效的艾滋病实验室监测：非洲的典范模式

摘要

在南非，针对艾滋病/艾滋病病毒的抗逆转录病毒治疗正在大规模开展监测。通过流式细胞术，结合血液学（CD45）、免疫学（CD4）以及与病毒载量相关的CD38检测方法进行综合分析。这些现代化技术在约翰内斯堡的南非国家卫生实验室服务署（NHLS-SA）实验室中实施，具有成本效益高、本地内部质量控制严格的优势，为资源有限地区的诊断体系提供了可借鉴的典范。

摘要

本文介绍了一种通过完善的实验室服务辅助抗逆转录病毒治疗（ART）的方案——展示了南非在经济型大规模诊断检测方面的典范模式。在低收入国家，廉价的抗逆转录病毒治疗已显著改善了HIV血清阳性患者的生存前景，但在病理服务整体质量仍然较低的情况下，是否需要对ART进行实验室监测以及相关成本如何，仍存在争议。对此的恰当回应是建立经济高效、协调更佳且内部质量评估比西方国家更为严格的实验室服务体系。本视频在南非约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学的国家卫生实验室服务（NHLS-SA）实地拍摄，展示了一种协调统一的检测方案，该方案扩展了原有的双色CD4-CD45泛白细胞门控策略（PLG）。因此，视频的六个模块展示了如何通过单管四色流式细胞术检测，简便地整合血液学、免疫学及与病毒学相关的检测项目。这些视频模块包括：（i）仪器的设置；（ii）样本制备；（iii）利用微球计数速率对每份样本进行绝对计数检测并实施质量监控；（iv）血液学CD45检测，用于白细胞计数及分类；（v）CD4细胞计数；以及（vi）通过CD38表达水平测量CD8+ T细胞的活化状态，该指标与病毒载量相关。该方案具有显著的成本节约潜力。此体系是每日可完成>800-1000次检测的可行性典范，其质量控制比西方实验室更为严格，并可在NHLS-SA网络内的其他实验室间实现技术转移。负责决策引入现代医学技术的专家顾问、实验室管理者和政策制定者，往往无法亲见大型区域实验室在高负荷工作下所采用的最新技术细节。因此，本视频详细呈现了这些新技术进展。

方案

引言

现代生物医学领域的科学研究带来了诸多实际效益，包括高效传染病诊断技术的开发。由于全球旅行导致疾病传播的风险，以及病毒和细菌感染在全球贫困地区的严重危害，对高质量且快速的诊断方法需求迫切¹。

在资源匮乏的国家，抗逆转录病毒治疗（ART）已成功用于治疗HIV阳性患者^2,3。目前ART的治疗方案主要基于以下三个方面：（i）针对HIV阳性个体的血清学检测，（ii）每日一次的遗传性药物组合方案，作为“一线”ART治疗，以及（iii）CD4细胞计数和/或病毒载量检测，以确定启动ART的时机。然而，随着ART适用范围的扩大，现行方案正在发生变化，目前更宽松的指南建议在更高的CD4计数水平下更早启动ART²。尤为重要的是，尽管目前尚无有效的HIV疫苗^4,5，但让更多HIV阳性患者在较高的CD4+细胞/μl血液水平时接受ART治疗，甚至可能减缓HIV的传播。

因此，随着越来越多的感染者存活下来，HIV感染正逐渐演变为一种慢性疾病，比以往更需要有组织的医疗体系，但非洲地区实验室医学的落后状况可能仍是有效医疗服务的障碍 ⁶有观点强调，提供短期资助并不能带来可持续的解决方案。 ^7-9，目前由西方国家提供的与艾滋病相关的资助无法永久持续下去 ^8,92008年，低收入和中等收入国家在艾滋病项目上支出了156亿美元，其中约50%来自包括北美在内的外部资金来源。计算出的趋势显示，这一支出水平将增加至目前的2至3倍，除非当前的整体应对策略发生改变，否则到2031年艾滋病流行仍将持续存在。 ⁹.

因此，非洲国家必须通过加强艾滋病预防和更明智的成本节约措施来做出贡献 ⁹我们建议，最新的创新“榜样”模式将在资源匮乏的国家（如非洲或印度）建立并推广。这些地区正是科学家们能够充分受益于当前国际支持的地方，他们将利用自身技能进一步改进日常技术，从而推动全球发展。

在西方医学中，大型学术中心和医院的诊断活动通常被“部门化”，即不同学科可能存在各自独立的“兴趣领域”，导致诊断工作被分割为血液学、病毒学、逆转录病毒学、细菌学、血清学、免疫学和细胞学实验室，而不是在传染病实验室中采用统一的方法，使用最少数量的多学科诊断检测。此外，诊断检测也可能过于复杂且成本高昂。显然，这类服务需要更好地协调，但这种整合努力不太可能完全来自西方国家。因此，领先的实验室和研究机构，如南非国家卫生实验室服务（NHLS-SA）与南非约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学合作的机构，正面临一项额外任务：基于现代技术进一步开发、改进、调整方向并提升其具有成本效益的诊断能力。

在本视频中，我们介绍了用于监测艾滋病病毒感染者抗逆转录病毒治疗（ART）的流式细胞术方法。该技术以六个模块逐步呈现，将相关血液学、免疫学和病毒学检测项目组合于单管中进行，同时结合必要的内部质量控制（QC），以确保检测的可重复性¹⁰。所使用的单克隆抗体均为科学界广泛确立的方法。CD45试剂用于白细胞计数^11-13，与CD4联合使用可计数作为HIV主要靶细胞的“辅助性”T淋巴细胞^12-14。在同一管中检测CD8+ T细胞上的CD38活化标志物，作为与HIV病毒载量（VL）相关的检测指标，是一种“巧妙的策略”^15-17。为突出南非的贡献，我们指出，这些概念及其具有成本效益的实际组合方案均是在国家卫生实验室服务局（NHLS）与威特沃特斯兰德大学（Wits）的合作下，基于西方领先技术发展而成的^{10,12,13,16,17}。

这些检测方法需联合使用，以对接受长期抗逆转录病毒治疗（ART）的患者进行恰当的监测。当对其成本效益进行评估时，这种协调的流式细胞术技术已显示出经济性^16,18,19。这些单管检测方法相较于其西方同类检测、以及使用其他方法通过不同仪器单独完成或作为替代指标检测的类似试验，均具有成本优势。相关节约成本的具体细目在讨论部分列出。

为了推广这一基本而简单的技术（即在单管中利用四色流式细胞术），以视频形式展示其技术步骤至关重要。负责决策是否引进现代医学技术的专家顾问、实验室管理者和政策制定者，往往无法亲自观察到大型区域实验室在高工作负荷下所采用的最新技术细节。因此，本视频展示了在南非引入的新技术进展，以优化检测工作流程。 >每个工作日处理1000份临床样本 ^10,13,16,17.

实验方案

流式细胞术

实验采用4色流式细胞术进行，但也可使用2色在两个平行的试管中完成（见下文）。使用贝克曼库尔特XL-MCL流式细胞仪，该仪器具有稳定的流体系统²¹，但相同技术也可适用于其他流式细胞仪。所述技术可处理每日约800-1100个样本的大规模工作量^10,13。

模块 1：仪器的设置

每日例行内部维护需每天进行两次：分别在开机时和完成最后一个患者样本后。包括冲洗真空管路并使用 Clenz（5% 次氯酸钠；BC，Miami，FL）。此外，在每完成 30 个样本管的离心转盘运行结束后，需通过系统运行 Clenz 和蒸馏水，以尽量减少蛋白质沉积。

每日启动时检查真空度和压力读数，确认本底计数保持在可接受范围内（<100 个事件在 100 秒内）。在运行第一个血样后，通过检测鞘液的一份等分试样确定残留量 <1%。然后每天使用 FlowCheck 样品监测激光对准和荧光灵敏度 ²¹. 观察到平均通道数保持一致（500±50），且变异度较低（半峰变异系数值） <2%）。每周检查补偿情况；通过绘制FlowSet微球的图像，检查其平均通道值是否在预设目标值的1%范围内。 ²²在Levey-Jennings图上直观确认精密度，每日显示四个荧光通道（FL1-FL4）的平均通道数值及半峰变异系数（HPCV）值。随后在两个CD4水平上确认CD4计数的准确性。在进行PLG-CD4检测时，使用稳定化血液过程对照品（IMMUNOTROL），低值正常范围为（450-700 CD4细胞/μL）μl）以及低水平（100-200 CD4 细胞/μl，取决于批次；参考文献23）。这些免疫质控品的检测值应在均值的0.5个标准差（SD）范围内，且变异系数（%CV）应满足 < 国际BC-IQAP项目要求的5% ²⁴，英国国家血液学外部质量评估计划（UK NEQAS） ²⁵ 和 AFREQAS ²⁶重要的是，如视频中所示，通过这些简单而有序的措施，可靠的流式细胞仪能够保持所需的稳定性，既适用于绝对细胞计数（如CD4检测），也适用于用于激活标志物CD38的荧光强度测量。这种稳定性 recently 已被详细记录 ¹⁷ 证实了先前使用其他流式细胞仪的研究结果 ^15,27.

每周维护期间，列表模式数据（LMD）文件会被归档以备将来参考，随后这些已归档的资料将从流式细胞仪的硬盘中删除。

每月维护包括清洗试剂容器、鞘液管路、清洁液罐和废液罐。同时清洁采用旋转模式的进样头，并取出所有滤器进行清洗。此清洁工作还涵盖TQPrep和PrepPlus2（BC，FL）样本前处理站。用于手动制备样本的移液器须由实验室内部至少每3个月进行一次校准验证；若怀疑移液不准确，则应立即将移液器停止使用，并采取纠正措施。每六个月的维护由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, SA）安排进行。

模块 2：样品制备

CD45/CD4 双色全白细胞门控方案 ⁵ 贝克曼库尔特 FlowCARE 试剂盒 ²⁸ 用于裂解-免洗涤流程（IMMUNOPREP，Beckman Coulter，FL）。该试剂盒包含CD45-异硫氰酸荧光素（FITC；绿色）和CD4-藻红蛋白（PE；橙色）。Flow-Count微球²⁹ 批量购买，用于向样品中加入已知体积内含有特定数量的微珠，以发挥特殊的操作便捷性作用 ³⁰此操作采用与吸取血液体积相同的移液方法进行。因此，如模块3所述， bead计数率（BCR）处于预期范围内即表明该样本的移液操作准确无误。重要的是，此处使用一种称为“前向移液”（forward pipetting）的简单移液方法效果最佳，前提是使用同一支移液器和吸头，并以相同的操作方式完成微珠和血液体积的转移30。我们发现，前向移液在不同实验室之间具有最佳的整体一致性，无论是在操作人员能否在可接受的容差范围内达到移液目标，还是在重复分配的重复性（以变异系数%CV衡量）方面均表现如此。 ^10,31,32。该方法曾在地方性学术会议上报告 ³²，已获准在南非国家认可体系（SANAS，www.SANAS.co.za）指南下使用。该BCR bead的使用方法与其他体积计数方法不同，后者最常使用冻干微球产品（如BDS Trucount试剂），其中含有已知数量的微球。这些试剂可通过流式计数率（FCR）方法，有效记录流式仪器流体系统的稳定性。 ^20,31然而，使用预装微珠的试管会使该技术更加复杂，因为必须将血液体积极其精确地加入这些试管中。通常认为，为达到这一目的，只有经过相应培训后采用“反向移液”技术才是可接受的。因此，与类似的替代方法相比，我们的BCR方法成本更低、信息量更丰富、操作更简便且易于学习——如视频中所示。 ^10,31,32我们还发现，使用正向移液操作的实验人员较少发生将样品吸入移液器内部的情况，而反向移液则可能导致移液器内部机械结构损坏，并需要重新校准，这在偏远地区尤为困难。我们的BCR方法还消除了中小型实验室（列表1）对自动化移液系统的依赖。

血液样本始终在II级生物安全柜中进行处理。为了避免拍摄过程中产生过多噪音，所展示的视频是在生物安全柜外使用安全材料重新演示的。流式细胞仪上的PLG-CD4采集协议允许在达到设定的时间限制时停止采集，或持续采集至5000个淋巴细胞事件，以提高对CD4计数较低样本的检测准确性。

模块3：珠计数率（BCR）

在本系统或每个对照样本中，通过公式“微球事件数/秒”计算微球计数率（BCR）^{10,13,30,32,33}。使用均值、标准差（SD）和变异系数（%CV）在电子表格中生成序列图，以识别BCR异常值³⁰。这些数据可验证移液、处理和分析三个系统的最佳运行状态，该流程称为样本制备验证（SPV），适用于手动移液或使用PrepPlus2自动移液仪移液的样本¹⁰。

采集过程中，BCR 结果可直接在显示器上实时查看。在 BC 流式细胞仪上，平均 BCR 值为 80±5 个事件/秒。我们展示了在发布患者结果前，异常的 BCR 会被识别并重新运行。决策树算法如图 1 所示（另见参考文献10）。

在纵向精度验证（LPV）过程中监测BCR时，仪器故障表现为BCR的波动，可用于检测移液趋势、模式及突发性偏移¹⁰。流路精度验证（FPV）是一项可选的内部操作程序，将单一批次的微球稀释液分装至10个试管中，依次上机检测，以确认可能存在异常的仪器是否出现流路不稳定的迹象¹⁰。

模块 4：CD45

在我们的研究中，为进行常规绝对计数，每天使用经每月校准的全血细胞计数分析仪LH-750（Beckman Coulter）作为白细胞计数（WCC）的参考标准，并以此与流式细胞仪的结果进行比对。流式细胞仪上基于CD45生成的WCC结果也通过与三个水平的稳定化Beckman Coulter 5C全血细胞质控品进行每日比对来验证。流式细胞仪CD45计数与全血细胞计数分析仪之间的WCC一致性可接受限值为＜5%¹⁰。这表明，当资源限制比我们实验室更为严格时，仅使用一台仪器（例如流式细胞仪）似乎已足以提供临床适用的白细胞计数，包括CD4细胞计数。

白细胞分类计数在多种血液学分析仪上进行，这些仪器在单核细胞计数的评估方面尤其存在差异。CD45表达模式是流式技术用于白细胞分类计数的经典应用^{11,12, 34}。由于流式细胞仪获得的CD45白细胞计数及其分类结果已被证实准确、精确且稳定可靠，因此可常规整合至PLG-CD4检测方法中，并可免费向临床医生提供。

在PLG-CD4方案的CD45/侧向散射图中观察到异常的CD45模式时，需通过染色血涂片进行随访，以提示进一步的临床检查。该方法可用于HIV阴性和HIV阳性患者中检测感染（细菌性和病毒性）、白血病和淋巴瘤^{34, 35}。在对HIV阳性患者进行常规实验室随访时，血液学实验室通常未被要求进行全血细胞计数。因此，在送检CD4计数的样本中若明确观察到异常CD45模式，则具有诊断意义。另一优势在于，即使在血液中发现白血病或淋巴瘤的患者中，仍可准确测定绝对CD4计数³⁵。

CD45流式细胞术非常适合用于血液学的标准化。不同血液学仪器之间存在显著差异。我们建议引入基于CD45的流式细胞术质量控制方法，用于白细胞分类计数，以实现对各类血液学分析仪的比较与标准化^10,36。

模块 5：CD4

在 Beckman Coulter XL 软件上引入的 PLG-CD4 检测方案包含八个散点图，其中 4 个用于确定 CD4 计数，另外 4 个用于质量监控^12,13。在这八个散点图中，图 2 所示的两个散点图尤为重要。所有白细胞通过 CD45 和侧向散射（散点图 2 中的 A 区域）进行识别，而碎片、红细胞/鬼影细胞和血小板则被排除。CD45+ 事件随后转入散点图 3，在此根据其强 CD4 表达和低侧向散射特征识别 CD4+ 淋巴细胞（C 区域）。绝对 CD4+ 淋巴细胞计数由 C 区域内的事件数和 WCC（Flow Count 校准区域 F 中的数据）计算得出。CD4% 淋巴细胞比例的数值来自散点图 2 的 B 区域。强 CD4 表达的 T 淋巴细胞与弱 CD4 表达的单核细胞可通过 CD4 荧光强度和散射特征加以区分，无需在试剂混合物中额外添加 CD3 T 细胞特异性抗体（详见参考文献13的综述）。

模块6：CD8/CD38

CD8-CD38 染色是使用 CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5 进行的四色染色的一部分。CD4/CD45 染色与上述相同（Flow Care PLG-CD4），额外添加的两种试剂为 CD8-ECD/CD38-PC5¹⁷。如果流式细胞仪仅能运行两种荧光颜色，则需增加一个检测管，使用溶血-免洗涤程序（IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL）进行 CD8-FITC/CD38-PE 双色染色。采用与 CD4 检测类似的设门策略，通过 CD8-ECD 与侧向散射光（图3）来识别 CD8+ T 细胞。CD8+ 淋巴细胞上的 CD38 表达水平以单参数直方图形式展示，即 CD38-PC5 的平均荧光强度（MFI）相对于细胞数量的分布^16,17。每位患者的每次随访所测得的 CD38 MFI 值按时间顺序依次绘图。首次随访（治疗前）的 MFI 值作为“基线”值，该患者后续各次随访的 CD38 MFI 值均与此基线值进行比较¹⁶。

对照与仪器稳定性（如模块1所述）基于每日采集Flow Check数据，以监测激光对准和电压稳定性。Flow Set用于设定所有四个荧光通道的颜色补偿（见上文）。Immunotrol作为“阴性”过程对照样本。“阳性”对照包括正常血液中表达约9 × 10³个CD38分子/细胞的单核细胞，以及未经处理的已知HIV阳性样本¹⁷。

南非国家卫生实验室服务局（SA-NHLS）实验室网络已采用

70个实验室间标准化的质量控制方法^{13, 33} 建立一个包含标准操作程序和培训材料的集中式数据库。通过开展讨论、提供进阶培训以及定期考核（包括对移液技术的审查），为网络中的各实验室提供支持。 ^32,33质量评估项目每月进行监测。通过这种方式，质量管理在区域层面实施，同时在南非国家健康实验室服务局质量保证部门的参与下保持高标准。^{13, 26}.

列表 1. 联合使用细胞计数技术在艾滋病疾病中的潜在成本节约：

1. 使用一台熟悉且拥有服务合同的仪器，而非应用多种血液学、免疫学和病毒学仪器
2. 在单个试管中完成多项检测，无需额外费用，也无需将样本在不同地点之间往返送检，包括白细胞计数（WCC）、白细胞分类计数、CD4检测以及用于预测抗逆转录病毒治疗（ART）应答的CD38 MFI监测
3. 通过CD38 MFI报告即时反馈ART治疗应答情况，显著缩短报告周转时间，优于传统的HIV病毒载量（VL）检测（实时报告）
4. 在同一报告单上整合结果评估，报告清晰且具有明确的临床应用价值
5. 由于采用简单的“前向加样”方法，并由BCR进行样本监控，可能无需使用自动移液仪器
6. 在操作过程中可识别样本处理不当的情况，并在结果授权前纠正有问题的检测结果
7. 对仪器故障实施主动预防性管理，可在严重故障发生前及时安排维修服务
8. 在常规检测服务过程中发现意外的白血病/淋巴瘤病例
9. 扩展类似的流式技术用于白血病的免疫表型分析及病情监测
10. 将CD38检测与保存干血斑（DBS）用于所有患者的HIV病毒载量检测相结合，仅在出现临床指征或CD38异常时才送检DBS，从而节约成本
11. 采用类似的流式技术替代结核病检测中的干扰素-γ ELISpot方法
12. 为开展“即时检测”（point-of-care）CD4检测的基层实验室提供质量控制支持
13. 节省“非必要”试剂（如CD3抗体及亚群标记物抗体）的开支，转而采购CD38抗体
14. 批量采购价格低廉的BCR检测微球（而非购买昂贵的预装计数管）
15. 在检测网络中，联合与商业公司谈判，获得更有利的批量采购价格

图 1. 当检测样本显示珠计数率（BCR）出现异常结果时所采用的决策树/算法。主要任务是区分移液误差与间歇性体积故障。该图显示了可能的误差原因，并指出了哪些实验方案的直方图和统计结果受到影响¹⁰。

图2. PLG CD4实验方案的一个示例，包含CD45-FITC（绿色；x轴）与侧向散射（复杂性；y轴），以及CD4-PE（橙色；x轴）与侧向散射（复杂性；y轴）的分析。门控“A”代表总的白细胞群体，其中选中的门控“B”为淋巴细胞群。将门控“A”转移至右侧第二张图，以识别门控“C”中的CD4+淋巴细胞。

图3. CD45/CD4 全白细胞门控检测（见图“2”和“3”；另见图2）与 CD8/CD38 检测（见图“4”和“6”）的联合应用。当将全部白细胞（门控“A”）传递至图“4”时，此处根据 CD8-ECD（“x”轴）和侧向散射光（“y”轴；如门控“D”所示）对 CD8+ 淋巴细胞进行圈门。随后将 CD8+ 细胞传递至图“6”，以在单参数图中显示 CD38-PC5 的染色强度，即图“6”中的参数“G”。记录 CD38-PC5 的平均荧光强度（MFI）。在抗逆转录病毒治疗（ART）过程中，该值逐渐下降^16,17。

讨论

近年来，慈善推动和资助拨款项目已帮助在全球艾滋病负担较重且资源有限的地区建立了一些优秀的临床实践。抗逆转录病毒治疗（ART）项目在降低死亡率方面已取得成功，并且目前开始在较高的CD4计数时启动治疗^2,3。已有迹象表明，尽管尚无针对艾滋病病毒的特异性疫苗，这些新措施将减少艾滋病病毒感染的传播^4,5。在我们的视频中，我们记录了在监测接受ART治疗的患者时，这些技术可以比西方实验室常规实践中所采用的方法更加集中且更具成本效益（表1）。

这种由非洲主导的方法可能对于支持实验室服务的升级至关重要，尤其是在艾滋病病毒感染经抗逆转录病毒治疗（ART）后正转变为一种慢性疾病的时代。对ART的此类监测需要精确的CD4计数以及与病毒载量相关的技术，其要求远高于仅通过CD4计数将患者划分为任意组别以辅助决定是否启动ART¹⁶。借助这些诊断手段，即使用CD8/CD38检测，有可能使接受ART治疗的患者中超过>60% 的人群在病毒载量相关监测方面的成本得以降低^16,19。还需要强调的是，能够及早发现病毒载量反弹和/或患者服药依从性不佳的指标，很可能是CD8/CD38检测^16,17，而非CD4计数³⁷。

协调且具有成本效益的中心化服务的一个关键要素，是拥有由熟悉操作技术与医学方面问题的专家和学术顾问支持的大规模国家或区域网络。南非国家卫生实验室服务（NHLS）网络以及CD4-PLG.net培训计划的活动^{33, 36}即为此提供了例证，这些网络为规模较小的中心提供支持、教育培训和质量评估，其中也可能包括“即时检测”服务。

重要的是，中心实验室与即时检测实验室的运作具有互补性。前者兼具提供大规模、低成本服务以及为外周实验室提供基础/高级培训的双重职能^33,38，而后者则通过从更广泛的范围内（包括农村诊所）招募符合抗逆转录病毒治疗（ART）条件的HIV阳性患者，有助于监测ART的推广情况。在此需保持一定谨慎，因为即时检测诊断的成本可能高得多，且不能自动保证准确性³⁸。因此，合理做法是保留这种两级体系，并促进两级之间的协调，同时防止任何一方的功能弱化。

总之，在传染病临床管理的诊断监测领域，通过采用费用更低、协调性更好的现代技术，可实现必要的节约成本，并显著提高质量^13,39。应加强对国家（和地区）层面诊断服务体系建设的支持^6-8，避免几乎所有资助资源都被浪费在昂贵和/或未经充分验证的方法上——这些方法一旦从发达国家引进，往往缺乏充分的预先审慎评估。同样，临床治疗试验的设计应更具灵活性，并充分吸纳当地医生和卫生保健人员的参与，从而减少不必要的频繁或过度激进的实验室检测³。该政策将有助于更充分地利用现有准确的诊断结果，通过协调一致的临床/实验室评估对接受抗逆转录病毒治疗（ART）的患者进行管理。这类智能化诊断技术也可借助已有的、熟悉的流式细胞术平台⁴⁰，率先在资源匮乏国家的结核病和白血病领域推广应用⁸。