环境诱导的亚麻可遗传变化

摘要

在营养胁迫条件下种植某些亚麻品种会导致基因组部分区域出现基因组变异以及表型变异。特定位置的一个复杂插入与不同营养条件下的生长表现以及该位点附近基因表达的变化相关。

摘要

某些亚麻品种会通过修饰其基因组来响应营养胁迫，且这些修饰可遗传给后代多代。与这些基因组变化相关的还有可遗传的表型变异^1,2。亚麻品种 Stormont Cirrus (Pl) 在三种不同营养条件下生长时，可能保持可诱导状态（在对照条件下），或分别在高营养或低营养条件下稳定地转变为大型或小型基因型型（genotroph）。在每种条件下最初生长产生的品系，在后续世代中若继续在相同条件下生长则表现更佳；值得注意的是，Pl 品系在对照处理下生长最好，表明在高营养和低营养条件下生长的植株均处于胁迫状态。与可遗传变化诱导相关的基因组变化之一，是在植物处于营养胁迫生长条件下时出现一种插入元件（LIS-1）^3,4。就这一插入事件而言，亚麻品种 Stormont Cirrus (Pl) 在三种不同营养条件下生长时，可能保持不变（在对照条件下），或在所有植株中均出现插入（在低营养条件下），并可将此插入传递至下一代，或出现插入（或其部分序列）但无法在世代间传递（在高营养条件下）⁴。该插入事件出现的频率表明其处于正向选择压力下，这也与后续世代中的生长响应一致。在不同生长阶段采集的叶片或分生组织用于 DNA 和 RNA 的提取。RNA 用于鉴定与不同生长环境和/或 LIS-1 存在与否相关的表达差异。分离的 DNA 则用于鉴定发生插入事件的植株。

方案

1. 在诱导条件下亚麻的生长。

1. 5" 花盆装入土壤并压实。
2. 每个花盆中播种3粒种子，深度为¼英寸，并将土壤轻轻压实覆盖种子。
3. 然后用100 ml相应的营养液对花盆进行浇灌
   1. 非诱导对照（C）条件使用1/10^th 每周施用全浓度 Miracle-Gro。高营养条件（NPK 处理）每周施用全浓度 Miracle-Gro。低营养条件——植物在整个生长期间仅施用自来水。（Durrant 1971，Cullis 1980）。
4. 植物在夏季于自然光条件下生长，冬季则在钠灯下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。
5. 每周定期采集叶片和分生组织。
6. 植物材料在液氮中迅速冷冻。

结果

三种基因型的相对生长速率因培养条件不同而有所差异（图1）。在对照条件下，Pl系的生长状况最好，且L系的生长活力强于S系（图1a）。在低营养（水分）条件下，S系的生长优于L系和Pl系（图1b）。在高营养（NPK）条件下，L系的生长优于Pl系，而Pl系仅略优于S系（图1c）。图1d–f展示了三种不同处理条件下各品系生长情况的比较。Pl系在对照条件下生长最佳（图1d），L系在高营养条件下生长最佳（图1e），而S系在高营养和对照条件下生长表现相似（图1f）。

这些数据表明，这三种菌株在三种不同环境下的生长情况存在差异，可以据此加以区分。值得注意的是，Pl 在对照条件下生长最佳，而 L 在 NPK 条件下生长最佳（该菌株即在此条件下诱导获得）。S 在三种条件下的生长水平大致相同，即其无法利用营养条件的改善来促进生长，但在极低营养条件下仍具有相对较好的生长能力。

与植物分化相关的生长参数包括植株高度（以及与此相关的节间长度，即每片叶子之间的距离）、叶片大小和分枝程度。在对照条件下，Pl植株较高，具有分枝，叶片大且呈深绿色。在低营养条件下，植株非常矮小，叶间距也很短，叶片小且呈浅绿色。茎顶端的叶片比下部的叶片颜色更深。在高营养条件下，植株外观与对照条件下的植株非常相似，但主茎和侧枝均比对照植株短。对于大型基因型（large genotroph），植株外观与Pl植株非常相似，但其在高营养条件下的生长最为旺盛。在低营养条件下，该基因型植株同样非常矮小，叶片呈浅绿色。S基因型在三种环境中生长表现相似，尽管在低营养条件下叶片颜色较浅。然而，在低营养条件下，S基因型的生长活力明显强于Pl或L品系。

2. 亚麻分生组织和叶片的RNA与DNA提取分别进行。RNA提取采用Roche总RNA提取试剂盒，DNA提取采用Qiagen DNeasy植物DNA提取试剂盒。

RNA 提取

1. 将3个分生组织及部分周围叶片从储存用冻存管转移至离心管中，并置于液氮中，直至准备研磨。
2. 向离心管中加入无菌砂，使用微型研磨杵研磨组织，直至呈细粉状。
3. 加入400 µl Roche总RNA提取试剂盒中的裂解/结合缓冲液，继续研磨组织，直至无可见团块。
4. 样品涡旋振荡15秒以促进裂解，然后在13,000 rpm下离心1分钟，以沉淀砂粒及任何残渣。
5. 将上清液转移至离心柱中，并按照RNA提取试剂盒说明书的后续步骤进行操作。

DNA酶处理

1. 加入1/10 RNA样本体积的10X DNA酶缓冲液。
2. 加入30单位DNA酶，反应体系在37°C孵育30分钟，然后在70°C孵育5分钟。

逆转录

1. 按照说明书使用 Applied Biosystems RNA 转 cDNA 试剂盒，反应在 37°C 孵育 1 小时，然后在 95°C 孵育 5 分钟。

然后将 cDNA 用于 PCR 或 qPCR

qPCR

使用 ABI Step One 系统进行 qPCR。每次运行中所有检测均设置三个重复。肌动蛋白基因作为拷贝数对照，是目前可用的最佳看家基因。

1. 每管中加入 1μl 适当的引物对。
2. 将 cDNA 稀释至适当浓度后，每管加入 9μl。
3. 每管中加入 10μl 2x Power SYBR Green PCR MasterMix (ABI)。
4. 扩增程序如下：
   • 95°C 下 10 分钟
   • 40 个循环：95°C 下 15 秒，60°C 下 1 分钟
   
   进行热变性步骤以验证扩增特异性
5. 相对表达水平通过 2(^{CT未知 - CT肌动蛋白}) 的值确定。

DNA 制备

1. 将Qiagen DNeasy植物DNA提取试剂盒中的AP1缓冲液加入含有6片叶片和无菌砂的微量离心管中。用微型研杵研磨组织，直至无可见团块。
2. 按照试剂盒说明书操作。

结果

从茎部不同位置叶片中提取的DNA进行PCR扩增，结果表明LIS-1的出现发生在植物处于诱导条件生长期间（4）。qPCR结果显示，LIS-1的存在（或与诱导相关的其他基因组变化）会影响LIS-1附近区域基因的表达（图2）。图2所示的六个基因在Pl和S中均表现出差异表达，其中四个基因在PL（无LIS-1）中表达水平较高，两个基因在S（含有LIS-1）中表达水平较高。图中第1和第2个基因为距离LIS-1插入位点最近的两个基因。要确定LIS-1与基因表达变化之间的因果关系，还需进一步研究大型基因型植株（已发生诱导变化但无LIS-1）中这些基因的表达情况，以及在不同生长条件下的表达模式。

图1. 三种不同养分条件下生长的Pl、L和S。图a - 对照，b - 低养分，c - NPK。d - Pl，e - S，f - L。图d - f从左至右分别为：低养分、对照和NPK。D - Pl，e - L，F - S。

图2. LIS-1插入位点附近的基因表达。基因1（生长抑制因子）位于LIS-1的5'端紧邻位置，基因2（Kip相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂id3）位于LIS-1的3'端。其他基因均位于基于完整亚麻基因组序列构建的同一支架上（约500 kb）。请点击此处查看高清图像。

图3. 从低营养条件下生长的Stormont Cirrus植株的单个叶片中提取DNA进行PCR扩增的结果。PCR产物在2%琼脂糖-TBE凝胶上进行分离。未插入位点显示在a图中，插入位点的两端分别显示在b图和c图中。叶片样本1-6按每周间隔分离，其中样本1为播种后最早采集的样本。

讨论

亚麻似乎具有内在不稳定的基因组。一些商用纤维亚麻品种在连续种植几代后会迅速变得不整齐。但这一现象在油用亚麻品种中似乎并不存在。因此，选育纤维品质与基因组不稳定性之间可能存在关联。环境诱导的可遗传变化最初是通过观察纤维作物农艺性状的研究发现的。这些可重复的特定表型与基因组变异现象引发了一个问题：环境胁迫如何影响可能发生的基因组重排组合。LIS-1在特定环境条件下反复出现，表明该突变可能受到直接或间接的选择作用。经不同处理诱导的品系在相应诱导条件下也表现出更优的生长表现。与LIS-1存在相关的基因表达变化再次表明，该插入事件影响了植株的性能表现。视频展示提供了一个观察植物表型变化的平台，其直观性是传统印刷材料无法传达的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
原始 Stormont Cirrus 品种的亚麻种子，标记为 Pl，以及其基因型变异体 L 和 S。
5" 花盆
育苗土
Miracle-Gro
温室
高压钠灯
液氮
研钵和研杵
微型研杵和微量离心管
PCR仪
琼脂糖凝胶电泳设备
数字成像系统
StepOne qPCR 模块
Qiagen DNeasy 植物DNA提取试剂盒
Applied Biosystems RNA 转 cDNA 试剂盒
Roche 总RNA提取试剂盒