本文描述了用于测量各种生物系统中生物电流的非侵入性振动探针的制造、校准和使用方法。
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摘要
摘要
由离子主动运输产生的电场广泛存在于许多生物系统中，通常在组织和器官中发挥重要的功能。例如，在伤口愈合过程中，电场在引导细胞迁移方面起着关键作用。本文描述了用于测量细胞外电流的超灵敏振动探针的制备与使用方法。该探针由一根绝缘的尖端金属丝制成，顶端涂有少量铂黑（30–35 μm），可在生理盐水中检测到μA/cm2量级的离子电流。探针通过压电弯曲元件以约200 Hz的频率振动。当存在离子电流时，探针在其运动两端之间检测到电压差。锁相放大器通过锁定探针的振动频率来滤除外部噪声。数据被记录到计算机中。实验开始和结束时，使用一个可施加精确为1.5 μA/cm2电流的校准室，在适当的生理盐水中对探针进行校准。本文详细介绍了探针的制作方法、系统的搭建与校准步骤。同时演示了角膜测量技术，并展示了来自不同样本（角膜、皮肤、脑组织）的一些代表性结果。
方案
1. 探针制备
空白探针购自World Precision Instruments（elgiloy/不锈钢镀派瑞林微电极）（参见下文“特定试剂与设备表”）。在探针尖端后方25–30 mm处进行切割，并用手术刀（#11刀片）刮除切端约5 mm长的派瑞林绝缘层，以确保良好的电连接。使用导电银环氧树脂（如Rite-Lok SL65）将探针固定于金质R30连接器中［*见下文注释］。探针在室温下静置过夜，使环氧树脂充分固化。随后，使用纳安级电源对探针尖端依次镀金和镀铂。首先将探针尖端用丙酮冲洗，然后连接至纳安级电源的负极输出端。在解剖显微镜（×40）下观察探针尖端，并将其首先浸入镀金液（蒸馏水中含0.2% w/v KAu(CN)₂的二氰合金酸钾溶液（dH2O）相连的参考电极插入溶液中以完成电路。首先施加5 nA电流持续5分钟，随后将电流增加至20 nA，直至尖端直径减小至所需最终尺寸的一半左右（约10-15 μm）。探针尖端用dH₂O冲洗2O，然后置于铂化溶液（氯铂酸水合物；1% w/v H2PtCl6 * 6H₂O）中2O）加醋酸铅(II)三水合物（0.1% w/v Pb(CH3COO)₂·3H₂O）2)2 * 3H2O 型，dH₂O2O）。施加 250 nA 电流持续 5 分钟，然后增加至 500 nA，直至尖端约为最终所需尺寸的 80%。随后将电流进一步增加至 1 μA 并以1秒的脉冲施加，直至达到最终尖端直径（约30-35 μm）。最后，用dH₂O冲洗尖端2O. 探针可无限期在室温下保存。若探针损坏，可重复使用金色 R30 连接器。
[* 注意：某些探针系统的探针安装部分直接与放大器相连以传输信号。而另一些系统则具有独立的安装点和信号连接器。对于后一种情况，在安装探针之前，需将一端带有R30连接器的短导线（2-3 cm）焊接到第一个R30连接器上（见图2A）。]
2. 探针系统
探针安装在三维微位移器上的压电弯曲器上（图1）。探针的振动由振动探针电源控制，该电源还可调节振动的幅度和频率。探针电源向锁相放大器发送参考信号，同时显示振动频率和相位角。连接示波器也很有用，可快速直观地观察探针的振动情况。探针的信号输入至锁相放大器。探针和待测样品可通过带有光纤照明的解剖显微镜（放大倍数×6至×40）进行观察。在校准和样品测量过程中，溶液中必须放置参考电极和接地（地线）导线（见图2B）。放大器通过模拟-数字（i/o）接口与计算机连接。数据使用斯特拉斯克莱德电生理学软件的全细胞程序（WinWCP）进行记录。
锁相放大器设置：灵敏度 [200 μV]，动态分辨率 [正常]，偏移 [开启]，扩展 [×1]，时间常数：前 [10 s]，后 [0.1 s]。若需要更快的响应，可将前级时间常数降低至 3 s。偏移控制用于将探针信号轨迹调整至屏幕中央附近。若预期信号较大，可将轨迹向上或向下移动。
WCP 软件设置：记录时长 [204.8 s]，每通道采样点数 [1024]，采样间隔 [0.2 s]，电压范围 [+/- 0.2 V]。若预期出现较大电流，可将电压范围增加至 1 V 或 5 V。
3. 探针设置
必须对新探针进行测试，并确定其独特的频率和相位角。将新探针放入装有生理盐水的校准室中（见图2B）。接通电源，逐渐提高频率，直至观察到最大振动，此即探针的共振频率。使用该共振频率可能导致信号不稳定并产生记录噪声，因此需将频率下调10 Hz，以获得探针的工作频率（通常为150–200 Hz），实现“去调谐”。调整振动振幅，使探针的振动距离等于其尖端直径，此时在振动过程中可观察到探针尖端呈现“双像”（见图2B）。为确定相位角，将探针置于校准室的盐水中，并反复施加1.5 μA/cm2的电流。调节锁相放大器上的相位角，直至无响应信号出现。在此角度基础上增加或减少90°，即可获得最大响应，该角度即为探针的工作相位角。每个探针的频率和相位角应记录下来，以供后续实验使用。在实验过程中，必须保持频率、振幅和相位角的设置不变，否则将改变探针的响应特性。为方便起见，当电流方向为“南向北”时，记录曲线应显示向上的偏转（此处称为“峰”）；而电流方向为“北向南”时，则应显示向下的偏转（见图3A）。如果响应方向相反，可通过在相位角上增加180°来纠正，从而反转响应方向。有关探针工作原理、校准等方面的理论细节，请参见Reid et al.1。
校准：通过在校准室中向探针对施加精确为 1.5 μA/cm2 的“标准化”电流，记录探针的响应，以此计算样品中的电流（见图 2B、3A）。在测量样品前，需在适当的溶液中对探针进行校准，例如角膜测量时使用 BSS+ 人工泪液溶液。电流以两个方向施加：南-北和北-南，分别产生向上和向下的偏转，对应于外向和内向电流，具体取决于样品的取向。探针信号应具有稳定的基线和低噪声（比较图 3A 和 3B）。实验结束时，使用已蒸发的溶液对探针进行再次校准，以补偿因蒸发引起的渗透压变化。在数据分析时，实验前半部分的测量值应使用初始校准值进行计算，后半部分的测量值则使用实验结束时的校准值进行计算。
样品测量：可能需要设计一个腔室来固定和稳定样品。例如，图3C显示了带有金属丝环的培养皿，用于固定眼球以进行角膜测量。将盛有生理盐水的培养皿置于解剖显微镜下，并将样品上待测区域调整至视野中心并聚焦。然后将探针浸入溶液中，使其方向与样品表面平行，并同样处于焦点位置，确保其与待测样品点处于同一水平面。将探针移动到距离样品适当的位置（例如1-2 cm），开启振动功能（同时启动计算机软件开始记录），以建立稳定的（水平）基线（见图4A）。随后将探针移至测量位置，距离样品表面约50 μm。当新的（“峰值”）数值稳定后，再将探针移回参考位置，记录曲线随之返回基线。此过程可在固定时间点重复进行，以获得时间序列数据；也可在轻微移动或旋转样品后，在不同位置重复测量，从而获得空间电流分布图（见图4B、5B）。
数据分析：使用 WinWCP 进行数据分析（见图 5A）。上下移动水平的红色“零”线，使其与测量峰之前迹线基线平行。将垂直的绿色测量线移动至迹线基线上。绿色测量线底部的绿色输出读数应接近零（例如 0.00012）。该数值表示红色线与绿色线交叉点与蓝色迹线之间的差值。然后将红色线向上移动，直至其与峰顶平行。此时绿色线底部的输出读数即为以 mV 为单位的峰幅值。所有测量峰的数据以及校准数据均输入至 Microsoft Excel 电子表格模板中（见表 1）。相关的信息，如日期、探针编号、电压范围（VR）、所用溶液、测量位置、时间点等，也可一并输入该电子表格。需注明电流方向（流入或流出样品：“i/o”），并在“peak”列中将流入电流记为负值。最右列的电流值通过以下公式计算：电流 = 峰值 × (1.5 / 校准值)，其中 1.5 是校准时施加的 μA/cm2 电流值。因此：“unw1” = 12.45 × (1.5 / 56.12) = 0.33276907 μA/cm2。
4. 成功的关键
与所有电生理实验一样，关键设备的正确接地有助于消除噪声。因此，至少微操作器和显微镜的机身应接地，光源也可能需要接地（见图1）。操作者本身可能成为静电来源，因此在某些情况下，通过腕带接地可防止探针不稳定，但并非总是必要。由于锁相放大器能够滤除除探针振动频率以外的所有频率（例如电网的60 Hz干扰），因此无需使用法拉第笼。隔振台有用但非必需，坚固稳定的实验台或桌子同样适用。除Excel电子表格中的基本信息外（见上文），在实验记录本中记录其他有用信息也很重要，例如温度变化、药物添加等。若通过显微镜拍摄照片，应注明放大倍数。如适用，绘制样品示意图以标明探针测量的位置和/或方向也是有益的（见图6）。
具有挑战性的步骤
- 探针制备：探针与 R30 连接器之间必须建立良好的电连接。若在电镀阶段无任何反应，则可能由此原因造成。
- 校准：应使用与待测样品相匹配的生理盐水或培养基进行校准。校准室中液体不可过多或过少，以免影响响应结果。液面应平整，与校准室顶部齐平。
- 样品测量：需提前规划，例如是否需要制作特殊腔室以固定或安装样品（见图 3C）？测量时，探针应使其长轴与样品表面平行，从而使探针的振动方向（即所测电流的方向）垂直于样品表面（例如，见图 4B）。样品可移动和/或旋转，以便在不同位置进行测量。测量过程中，必须保持探针与样品表面之间距离的一致性。所测电流与探针距样品表面的距离成正比；当探针远离样品表面时，电流按平方反比定律衰减。即，当测量样品表面产生的电流时，所检测到的电流与距表面距离的平方成反比。可使用目镜测微尺来判断探针与样品表面之间的距离。
故障排除
- 问题：校准无响应。 解决方法：检查盐水是否接触两个电极，检查恒流校准仪的电池。
- 问题：信号过小。解决方案：用去离子水清洗探针2O 和/或丙酮。检查相位角。
- 问题：噪声或基线不稳定（见图3B）。 解决方案：检查接地线。
- 问题：信号迹线跳出屏幕。解决方案：禁止探针尖端接触样品。
5. 典型结果
图3A展示了一条良好的校准曲线示例。注意其稳定的（水平）基线、低噪声以及较大的响应信号。作为对比，图3B显示了一条噪声较高且基线不稳定的曲线。图4B展示了在小鼠角膜伤口不同位置测得的电流。上图显示了探针的位置，中图显示了计算机记录的探针信号，下图则为不同位置电流的图示，呈现出伤口电流的分布特征。图5B展示了在小鼠皮肤伤口处以固定时间间隔进行的测量，用于获取伤口电流随时间变化的数据。
图1. 振动探针系统。详细描述见正文。蓝色文字描述连接线的功能。绿色符号表示接地点。
图 2. A. 探针安装。在电穿孔之前，将探针用含银环氧树脂粘接固定于金质 R30 连接器中。在某些系统中，会焊接第二个连接器，并通过短导线引出信号。比例尺：3 mm。铂球未按比例绘制。B. 探针校准。恒流校准器（左侧）在校准室（右侧）中向探针施加 1.5 μA/cm2 的电流。左下方：探针特写。当探针振动时（右下方），调节振幅，使针尖呈现双像。比例尺：100 μm。
图 3. A. 探针校准轨迹。良好的探针校准轨迹示例，显示稳定的基线、低噪声和强响应。电流由南向北流动时产生向上的偏转，电流由北向南流动时则产生向下的偏转。B. 不稳定且噪声较大的探针轨迹。C. 用于固定小鼠（左）或大鼠（右）眼球以进行角膜测量的装置。标尺：5 mm。
图4. 测量结果示例。A. 当探针位于距样品参考位置1-2处时，建立稳定的基线。当探针移至靠近样品的测量位置时，检测到电流，曲线向上偏转（外向电流）。B. 跨越小鼠角膜不同位置的测量结果。探针方向与表面平行，因此振动方向垂直于表面。向上的峰表示外向电流。最大电流出现在伤口边缘（位置B和F）。右侧为探针在测量位置F（右伤口边缘）的示意图。比例尺：300 μm。
图 5. A. 探针信号轨迹分析。上图：将红色零线上下移动，使其与轨迹基线平行，然后将绿色测量线横移至基线位置，使绿色输出读数接近零（0.00012）。下图：再将红色线向上移动，使其与轨迹峰值顶部平行，此时输出读数即为以 mV 为单位的峰值大小（12.45）。根据校准数据（见表 1）可计算出相应电流值。B. 小鼠皮肤伤口时间序列数据。损伤前的电流值显示在时间零点（红色符号）。在小鼠皮肤伤口处的同一位置，于损伤后定期进行测量。损伤初期出现短暂的内向电流（低于零），随后电流发生反转，外向电流（正值）缓慢上升并趋于平稳。
图 6. 实验记录本示意图，显示探针测量位置。A. 大鼠脑组织；红色圆点表示测量位置，探针符号表示探针方向。B. 大鼠角膜伤口；红色圆点表示测量位置，箭头表示测得电流的方向。
表1. 用于存储和量化探针数据的Excel电子表格示例。pN2_cal1 = 初始校准值；cal+ 和 cal- = 以mV为单位的校准值；VR = 电压范围；peak = 以mV为单位的样品测量值；i/o = 电流流向（流入或流出样品）。
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讨论
我们介绍一种低成本、基础但高度灵敏的振动探针系统，可用于非侵入式地测量多种生物系统中的电流传导。
可能的修改
- 如果使用铂/铱电极（World Precision Instruments；货号 # PTM23B20）代替不锈钢电极，则可以省去镀金步骤。
应用
我们已使用振动探针测量了以下组织中的电流传导：大鼠角膜2；大鼠晶状体3,4；小鼠皮肤5；Xenopus 蝌蚪6；人皮肤7；人角膜8；斑马鱼胚胎1；盘基网柄菌1；大鼠脑组织1。振动探针最初由 Jaffe 和 Nuccitelli 描述9。一种可二维测量电流的计算机控制探针也已有报道10。相关的重要综述文献亦一并列入11...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢普渡大学瘫痪研究中心的理查德·博根斯（Richard Borgens）教授在组装振动探针系统方面提供的帮助。本研究得到了美国国立眼科研究所（NEI）NIH 1R01EY019101基金（资助对象：MZ 和 BR）的支持，部分研究还获得了加州再生医学研究所（CIRM）RB1-01417基金、美国国家科学基金会（NSF）MCB-0951199基金，以及“预防失明研究”组织向加州大学戴维斯分校眼科提供的无限制资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Eligoy-不锈钢电极 | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm，7 MΩ，尖端直径1-2μm |
| Gold R30 连接器 | www.vectorelect.com | R30 | 可重复使用 |
| 含银环氧树脂 | 3M | SL65 | 按1份树脂与1份固化剂混合 |
| 解剖显微镜 | Olympus Corporation | SZ40 | 放大倍数 x6 至 x40 |
| 二氰合金酸钾（KAu(CN)2） | Sigma-Aldrich | 379867 | 注意：有毒 |
| 氯铂酸水合物（H2PtCl6 × 6H2O） | Sigma-Aldrich | 520896 | 注意：有毒 |
| 乙酸铅三水合物（Pb(CH3CO2)2 × 3H2O） | Sigma-Aldrich | 185191 | 注意：有毒 |
| 纳安级电源 | 自制 | - | 由六节1.5 V（AAA）电池供电 |
| 三维微位移调节器 | Line Tool Co. | Model H | |
| 锁相放大器 | Stanford Research Systems | SR530 | |
| 数字输入/输出接口 | National Instruments | PCI-6220 | |
| 带BNC接口的屏蔽连接模块 | National Instruments | BNC-2110 | |
| 斯特拉斯克莱德电生理学软件 | 英国斯特拉斯克莱德大学药学与生物医学科学研究所 | WinWCP V4.1.5 | 可从以下网址免费下载：http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| 校准室 | 自制 | ||
| 恒流校准仪 | Vibrating Probe Company | 由一节9 V（PP3）电池供电 |
参考文献
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).
- Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: the role of electric currents. FASEB J. 19, 379-386 (2005).
- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
- Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract. FASEB J. 19, 842-844 (2005).
- Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts. J. Invest. Derm. , (2010).
- Reid, B., Song, B., Zhao, M. Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration. Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ. 442, 457-460 (2006).
- Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. , Forthcoming (2010).
- Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).
- Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns. J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).
- Nuccitelli, R. Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues. Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).
- Levin, M. Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).
- Zhao, M. Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).
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