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1. 样品制备
Western blotting 的第一步是样品制备。为了制备用于跑胶的样品，需要裂解细胞和组织以释放目标蛋白质。
- 一种方便、即用型且用途广泛、易于使用的可溶性蛋白提取试剂是 CytoBuster 或 PhosphoSafe。这些提取缓冲液含有经优化的去污剂，可高效地从哺乳动物和昆虫细胞中提取可溶性蛋白。CytoBuster 蛋白提取试剂采用温和的非离子型配方，能够分离出具有功能活性的内源性或表达蛋白，无需超声处理或反复冻融等后续步骤。PhosphoSafe 还额外含有四种磷酸酶抑制剂，具有更优性能。
- 通过低速离心（例如 2500 × g 离心 5 分钟）收集细胞，弃尽上清，充分沥干细胞沉淀。
- 用 CytoBuster 蛋白提取试剂重悬细胞，每 106 个细胞使用 150 μL（CytoBuster 蛋白提取试剂的最佳用量可能因细胞大小而异）。
- 室温孵育 5 分钟。
- 转移至合适离心管中，在 4°C 下以 16,000 × g 离心 5 分钟。
- 将澄清的上清液（细胞提取物）转移至新管中，即可进行后续分析。
- 对于特定蛋白的提取，我们推荐使用高质量的 ProteoExtract 试剂盒。EMD 提供十余种试剂盒，可用于线粒体分离、亚细胞蛋白质组提取、跨膜蛋白提取等多种应用。更多详情，请访问我们的 Western blot 专题页面。
- EMD 还提供多种蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物试剂盒。细胞裂解一旦发生，蛋白水解、去磷酸化和变性过程即刻开始。若样品始终置于冰上或 4°C 环境中，并在裂解缓冲液中新鲜添加适当的抑制剂，则可显著减缓这些过程。更多详情，请访问我们的 Western blot 专题页面。
2. SDS-PAGE
Western印迹的第二步是蛋白质分离。蛋白质根据分子量进行分离。
- 您可以自行制备PAGE胶，但本实验将使用 commercially pre-cast gel（商用预制胶）。
- 在样品制备完成后，即可进行蛋白浓度测定。EMD提供两种用于浓度测定的试剂盒：Non-Interfering Protein Assay Kit 和 BCA Protein Assay Kit。
- 在测定蛋白浓度后，即可准备上样。抗体通常识别目标蛋白的一小段区域（称为表位，epitope），而该区域可能位于蛋白的三维构象内部。为了使抗体能够接触到该区域，必须将蛋白展开。
- 为实现变性，需使用含有阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）的上样缓冲液，并将混合物在95–100°C下煮沸5分钟。一种简便且常用的上样缓冲液是4X Sample Buffer。
- 在加样孔的第一道中加入Trail Mix Protein Marker。该蛋白标记物含有三条参考条带，可用于监测电泳进程。染色后可见10条条带，分子量范围为10–225 kDa。
- 向电泳装置中加入电泳缓冲液。对于PAGE胶，通常使用1X Tris-glycine缓冲液。如需详细的缓冲液配方，请访问Western blotting页面。EMD通过OmniPur化学试剂系列提供高质量的缓冲液试剂。将凝胶在220 V条件下电泳运行1小时。
- 蛋白分离完成后，使用考马斯亮蓝（Coomassie blue）对凝胶染色，以确认蛋白迁移是否均匀一致。RAPIDstain是一种超敏型即用型染色液，无需脱色步骤。
3. 蛋白质转印
正如带电荷的蛋白质可以在电场作用下在凝胶中移动一样，这些蛋白质也可以在电场中从凝胶转移至膜上，该膜可以是聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜。
- 今天我们将进行湿法转膜。在湿法转膜中，凝胶和膜被夹在海绵和滤纸之间（海绵/滤纸/凝胶/膜/滤纸/海绵），确保凝胶与膜之间无气泡后，将整个“三明治”结构紧密夹紧。然后将该结构浸入转移缓冲液中，并施加电场。带负电荷的蛋白质会向带正电荷的电极方向迁移，但会被膜截留并结合，从而阻止其继续移动。
- 目前有两种类型的膜可供选择：硝酸纤维素膜（nitrocellulose）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。两种膜均有良好的转膜效果。今天我们将使用PVDF膜。PVDF膜需先在甲醇中浸泡数分钟，再用冰冻的转移缓冲液浸泡5分钟。凝胶也需在冰冻的转移缓冲液中平衡数分钟。若未进行此步骤，可能导致转膜过程中凝胶收缩。
- 湿法转膜所用缓冲液为含20%甲醇的1X Tris-甘氨酸缓冲液。详细的缓冲液配制方法可在我们的网站上查阅。
- 转膜完成后，建议对蛋白质进行可视化检测，以确认转膜均匀且无气泡产生。可使用RedAlert Western Blot Stain染色液轻松实现此目的。该染色液为即用型，且可直接用水进行脱色。
4. 抗体及辅助试剂
- 进行探针和抗体与抗原结合的第一步是封闭膜。封闭膜可防止非特异性背景结合。
- 可使用脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）作为封闭液。然而，在使用磷酸化特异性抗体时，不建议使用奶粉，因为它会导致高背景信号。
- EMD 提供多种高质量的封闭试剂，包括 SeaBlock（一种非哺乳动物来源的封闭剂）和 BLOT QuickBlocker（一种即用型封闭剂）。我们还提供高品质的 BSA（第五组分）。
- 将膜在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
- 孵育后用 TBST 或 PBST 洗涤三次。配制 TBST 或 PBST 的简便方法是使用我们的片剂（PBS TWEEN 片剂 / TBS TWEEN 片剂）。
- 膜封闭完成后，即可进行一抗孵育。EMD 三十多年来一直提供种类全面、品质卓越的抗体产品，并拥有业内最佳的抗体保障承诺。请记住，所有 EMD 抗体均享有完整的 100% 无风险保证。购买任意抗体后，您可在任何物种特异性或应用中使用，若抗体未达到您的满意效果，我们将提供全额信用额度，可用于兑换其他任何产品。更多详情，请访问我们的 Western blotting 网页。
- 今天我们将使用 SignalBoost 的溶液 1 来孵育一抗。SignalBoost 是一种优异的产品，可显著增强信号强度。只需将一抗加入溶液 1 中，按常规方式孵育 1 小时即可，无需额外添加封闭剂。或者，您也可使用 BSA 或脱脂奶粉作为封闭剂。
- 用 TBST 洗涤。我们使用即溶型 TBST 片剂配制 TBST。
- 使用 SignalBoost 的溶液 2 孵育二抗。将二抗在封闭缓冲液中孵育 1 小时，然后再次用 TBST 多次洗涤膜。
5. 检测
对于HRP标记的二抗，传统上使用ECL显色。我们提供的一种优质ECL试剂是RapidStep。RapidStep的优点在于无需混合鲁米诺或增强剂，只需将膜喷洒数次，然后使用X光片显影即可。RapidStep具有皮克级的高灵敏度，并且在加入底物后可持续发光长达2小时。