我们介绍一种通过聚合酶链式反应（PCR）进行DNA扩增的新方法。该方法利用热对流，通过将反应器相对表面维持在恒定温度，使试剂在变性、退火和延伸条件下持续循环。这种本质上简单的设计有望使快速PCR技术更易于普及。
本文内容
摘要
摘要
许多分子生物学检测在某种程度上都依赖聚合酶链式反应（PCR）来扩增初始浓度较低的目标DNA样本，使其达到可检测的浓度水平。然而，传统PCR热循环仪的硬件设计主要基于体积庞大的金属加热块，其温度由热电加热器调控，这种设计严重限制了反应速度1。此外，反复加热和冷却试剂混合物需要消耗大量电能，从而限制了此类仪器向便携式形式发展的可能性。
热对流作为一种有前景的替代性热循环方法，有望克服上述局限性2-9。对流现象在多种环境中普遍存在，从地球的大气、海洋和内部结构，到装饰性的彩色熔岩灯，均可观察到。在这些情况下，流体运动的起始机制相同：当受限体积的流体受到空间温度梯度作用时，会引发由浮力驱动的不稳定性。这些相同的物理现象为实现PCR热循环提供了一种理想途径。通过在适当设计的反应器几何结构上施加一个稳定的温度梯度，可建立持续的循环流动，使PCR试剂反复经过与变性、退火和延伸反应阶段相对应的温度区域（图1）。因此，只需将两个相对表面维持在恒定温度，即可以准等温方式驱动热循环，完全无需反复加热和冷却仪器。
对对流式热循环仪设计的主要挑战之一，是需要精确控制反应器内的空间流速和温度分布，以确保试剂在正确温度区域停留足够长的时间10,11。本文描述了我们对微尺度对流式热循环仪中完整的三维流速和温度分布进行探测的研究结果12。出乎意料的是，我们发现了一类复杂的流动轨迹，其对PCR极为有利，原因在于：（1）不同流路之间持续交换，使试剂能够更充分地经历最佳温度分布的全范围；（2）在PCR速率限制步骤——延伸温度区停留的时间显著延长。在设计用于产生此类流动的反应器中，可实现极快速的DNA扩增（不到10分钟）。
方案
1. 对流式热循环仪的基本设计
- 我们构建了一种简单的对流式热循环装置，该装置由可互换的塑料反应室“卡盒”组成，卡盒夹在两块铝板之间，铝板的温度可独立控制7（图2）。
- 通过在聚碳酸酯块上加工阵列孔嵌入圆柱形反应器孔，采用不同孔径与塑料片厚度的组合，以实现所需的高度/直径比（高度/直径 = h/d）。本文所展示的结果中考虑了两种不同的反应器几何结构：h/d = 9：h = 15.9 mm，d = 1.75 mm，体积为38.2 μL；h/d = 3：h = 6.02 mm，d = 1.98 mm，体积为18.5 μL。
- 反应器的底面通过一个内置筒式加热器的铝块加热，该加热器与由微处理器驱动的温度控制器相连。
- 反应器顶面的温度通过连接至循环水浴的铝块进行调控。
- 整个组件通过尼龙螺钉夹紧，以限制相对的两块铝板之间的热传导。
2. PCR反应体系的制备与加样
- 一个典型的 100 μL 反应体系包含 10 μL 10x 缓冲液、6 μL 25 mM MgCl2、10 μL dNTPs（每种 2 mM）、41.2 μL 去离子水、10 μL β-actin 探针、10 μL β-actin 正向引物、10 μL β-actin 反向引物、2 μL 人基因组模板 DNA（10 ng/μL）以及 0.8 μL KOD DNA 聚合酶（2.5 单位/μL）。
- 在加入试剂前，使用一片薄铝箔胶带密封 PCR 反应室的底面。
- 用 10 mg/mL 的牛血清白蛋白水溶液冲洗反应池，随后用 Rain-X Anti-Fog 处理。
- 使用长型加样枪头将试剂加入反应池中，并用 FEP 聚四氟乙烯胶带密封上表面。
3. 在对流式热循环仪中运行反应
- 开始反应前，将两个铝块预热至所需的上下表面温度。
- 将装有PCR试剂的塑料反应器夹在铝制加热块之间，并使用尼龙螺丝迅速将组件夹紧。
- 反应进行至所需时间后，关闭加热器，并将装置的下部（热）表面放置在预冷的金属块上，以快速冷却并终止对流流动。
- 取出塑料反应器，用长型凝胶加样吸头吸取各孔中的产物，用于后续分析。
4. 进行凝胶电泳分析
- 在搅拌加热板上将10 g琼脂糖与500 mL 1×缓冲液加热，制备2 wt%琼脂糖凝胶，直至溶液变得澄清。
- 将琼脂糖凝胶倒入制胶板中，并插入梳子。让凝胶静置约30分钟使其凝固。
- 移去梳子，并加入1×TAE缓冲液至完全浸没凝胶。
- 荧光染色的DNA样品包含2 μL 100× SYBR Green I溶液、2 μL DNA样品、2 μL 6×橙色上样染料以及4 μL TAE缓冲液。
- 将DNA样品加入加样孔中，使用100 bp DNA分子量标记物，在60 V电压下电泳运行1小时以实现分离。
- 取出凝胶并在紫外光下成像，以获得结果。
5. 典型结果：
对对流式热循环仪的优化设计涉及选择合适的反应器几何结构，以产生能够携带试剂通过PCR过程关键温度区域的循环流动。在本研究考虑的圆柱形反应器中，可调节的几何参数包括高度（h）和直径（d），或等效地表示为高径比（h/d）。我们利用计算流体动力学（CFD）方法，在多种不同的高径比条件下，研究了对流式PCR反应器内部的三维流场，发现会出现出乎意料的复杂流动模式。更重要的是，我们的分析揭示了其中一部分复杂的流场可显著加速反应过程12。
通过比较高宽比和低宽比反应器中的流场，这些几何效应可以清晰地观察到。在高宽比情况下（h/d = 9；一个高而细长的圆柱体）中，流体单元沿着基本闭合的环路轨迹被输运，并在较长时间内被锁定在相同的路径上（图3a）。因此，能够使试剂暴露于PCR所需最佳热循环条件（在反应器顶部和底部表面之间交替经历退火与变性极端温度）的流体轨迹，与数量大得多但不参与扩增的其他轨迹（更集中分布在反应器中心区域附近）之间，几乎无法实现有效的物质交换。
当长径比更小时（h/d = 3；即更短且更宽的圆柱体），流场表现出显著差异，流体微团的轨迹不再遵循闭合路径，流动呈现出更强的混沌特性（图3b）。因此，尽管试剂经历了更为复杂的温度分布，但流体微团能够探索更广泛的轨迹路径，使得更大比例的试剂体积有机会经历最优的热循环条件。这些结果具有反直觉性：尽管在 h/d = 9 时的单个流道轨迹可能因产生“看似”与传统热循环仪相似的温度分布而显得更有利于PCR反应，但在全局尺度上，h/d = 3 时流场的混沌特性起主导作用，通过促进增强的物质交换，避免试剂长时间被困在不利的流动路径中。
为了验证这一假设并确定哪种反应器几何结构更有利于PCR，我们使用这两种结构对人基因组DNA模板中与β-actin基因相关的295 bp目标片段进行PCR扩增。结果表明，在h/d = 3时，仅需10分钟即可常规扩增出正确的目标产物（图4a）；而在h/d = 9时，同一反应至少需要20分钟才能观察到可检测的产物（图4b）。在h/d = 3时，反应特异性也显著更高，仅产生单一的PCR产物；而在h/d = 9时，由于流场使流体单元长时间滞留在不利的热循环路径中，会产生多个非特异性产物。
图1. 在一个顶部和底部表面维持不同恒定温度的圆柱形腔室中的热对流现象。当底部表面温度高于顶部时，封闭流体内部会形成垂直密度梯度，从而产生循环流动模式。通过合理选择几何参数（高度 h 和直径 d），当顶部和底部表面分别维持在退火和变性温度附近时，可利用该对流流场驱动PCR热循环（重力方向垂直向下）。
图2. （a）对流式PCR热循环仪的关键组件。反应器盒由一块聚碳酸酯块构成，内部包含一系列圆柱形腔室。该聚碳酸酯块夹在顶部平板与底部平板之间：顶部平板设计用于连接循环水浴装置，底部平板则集成有嵌入式加热元件。（b）将PCR试剂加入并密封于反应器盒内后，组装设备以进行反应。反应完成后，产物可轻松通过移液取出，用于后续分析。
图3. 在圆柱形反应器内产生的三维对流流场的计算模拟结果，其中顶部和底部表面分别设定为53和96 °C。结果显示了两种长径比条件下的情况：(a) h/d = 9（反应器体积为38.2 μL）和(b) h/d = 3（反应器体积为18.5 μL）。左侧展示了流体微元在三维流场中运动的代表性轨迹，以及该路径的俯视图和侧视图投影；右侧为流体微元经历的温度随时间变化曲线。当h/d = 9时，其温度分布与传统热循环仪相近，但h/d = 3时的混沌流场反而更有利于PCR反应，这一结果看似违反直觉。
图4. 在图3所示的反应器几何结构中获得的DNA复制结果（上表面和下表面分别维持在53和96 °C）。(a) 当h/d = 3时，PCR显著加速，反应仅进行10分钟后即可观察到明显的扩增产物（M：100 bp DNA标记物，泳道1–4：来自4个不同圆柱形腔室中平行反应的产物）。(b) 在h/d = 9条件下进行的相同反应至少需要20分钟才能观察到可见产物，且出现多条条带，表明除目标产物外还发生了非特异性DNA扩增（M：100 bp DNA标记物，泳道1–2：来自2个不同圆柱形腔室中平行反应的产物）。
讨论
在混沌对流的影响下，流动与化学反应之间的相互作用可能会发生显著变化。然而，这些复杂的流动状态难以研究，尤其是在三维效应变得重要的真实几何结构中。当 h/d > 1 时，瑞利-贝纳德对流不仅为探索这些现象提供了便捷的平台，其在 PCR 中的应用还使得流动与化学反应之间的耦合得以被研究。这一独特能力使得可以选择出最优的流动状态，其中混沌效应以违反直觉的方式加速 DNA 复制的速率。
致谢
我们衷心感谢 Lynntech 公司的 T. Ragucci、B. Watkins、S. Wong 和 B. Wallek 提供的技术支持和许多有益的讨论。本工作得到了美国国家科学基金会（NSF）资助 CBET-0933688 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KOD DNA聚合酶试剂盒 | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-肌动蛋白对照试剂盒 | Applied Biosystems | 401846 | |
| 铝箔胶带 | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X 防雾剂 | SOPUS Products | ||
| 长型凝胶加样吸头 | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP 铁氟龙胶带 | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| 琼脂糖凝胶 | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE 电泳缓冲液 | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x 橙色上样染料 | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder 分子量标记 | Bio-Rad | 170-8202 |
参考文献
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