大鼠主动迟发型超敏反应（DTH）的诱导与监测

摘要

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应。本文演示如何在Lewis大鼠中诱导主动DTH反应，并监测其炎症反应过程。

摘要

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润到免疫系统已致敏抗原的注射部位。该炎症反应的特征是抗原攻击部位出现红肿。DTH是评估免疫抑制剂体内疗效的便捷模型。皮肤DTH可通过过继转移抗原特异性T淋巴细胞，或通过抗原主动免疫后，在特定皮肤区域进行皮内抗原攻击以诱导炎症反应。DTH反应可针对多种抗原诱导产生，例如卵清蛋白、结核菌素、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白（KLH）。

本文演示如何在Lewis大鼠中诱导主动迟发型超敏反应（DTH）。首先，我们将制备含有我们感兴趣的抗原KLH的水包油型乳剂，将其溶于完全弗氏佐剂中，并将该乳剂皮下注射至大鼠体内。此步骤可启动免疫系统，使其产生针对KLH的记忆T细胞。七天后，我们将在大鼠背部进行皮内攻击：一侧注射KLH，另一侧注射无关抗原卵清蛋白（ovalbumin）。炎症反应将在16至72小时后显现，通过测量红肿区域的大小来评估DTH反应的严重程度。

方案

1. 乳剂的制备

1. 乳剂是抗原（迟发型超敏反应可针对多种抗原诱导产生：卵清蛋白、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白等）的水溶液与完全弗氏佐剂按1:1比例混合而成。必须将抗原加入佐剂中，而不能反向操作！！！
   
   
2. 制备和注射乳剂时会有较多损耗，因此务必比所需量多准备1.5至2倍。
   
   
3. 将抗原溶解于生理盐水中，配制成2 mg/ml的溶液。不要过滤，以免损失聚集物！！！
   
   
4. 取完全弗氏佐剂H37Ra（Difco，货号# 231131）置于试管中，高速涡旋。在持续涡旋的同时逐滴加入抗原。待全部抗原加入后，继续涡旋5分钟以上。混合物应变为乳白色。
   
   
5. 将乳剂装入玻璃注射器，并用18G连接桥（Fisher货号# 14-825-17L）连接另一玻璃注射器。来回推动乳剂直至变得粘稠（5-10分钟）。最好使用两个5 ml注射器。若所需乳剂超过5 ml，应使用多组5 ml注射器。
   
   
6. 乳剂可在注射器中于4°C保存3周。

2. 大鼠的免疫

1. 将乳剂在注射器中混合几分钟，然后转移至用于注射的注射器中。使用23G针头和带有鲁尔锁扣的3 ml注射器，在尾根部1-2个位点皮下注射200 ml。

3. 在背部进行抗原攻击

1. 免疫后第7天，剃除大鼠背部两处毛发，分别在一处皮内注射20 ml浓度为1 mg/ml的抗原溶液，另一处注射生理盐水（或无关抗原）。切勿过滤抗原溶液，以免丢失可增强炎症反应的聚集体。
   
   
2. 为避免动物移动，应将大鼠进行麻醉。使用27G ½针头和1 ml注射器进行皮内注射，每次注射需更换针头。
   
   注意：为了获得更精确的测量结果，攻毒实验也可在耳廓进行，而非背部。详见视频 https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. DTH 的测量

1. 注射部位将开始发红并出现肿胀，这是炎症的迹象。使用直尺或更佳的游标卡尺测量炎症区域的直径。 肿胀程度通常在24至72小时内达到峰值。

讨论

为了更精确地测量DTH反应，我们建议用抗原刺激大鼠耳廓。随后可通过测量相关抗原刺激耳与仅用生理盐水或无关抗原刺激耳之间的耳部肿胀差异来评估反应。图1展示了耳部刺激的操作示范。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂’s佐剂 H37Ra	试剂	Difco 实验室	231131	由 Fisher 以目录号 DF 311-360-5 分销
钥孔血蓝蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	H-5654
卵清蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml 玻璃注射器	工具	Fisher Scientific	14-823-10 B	每批5 ml乳剂需要两个5 ml注射器
18G 金属桥	工具	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis大鼠	动物	Harlan Laboratories		7至9周龄的雌性大鼠
23G 1" 针	工具	Fisher Scientific	14-826 AA	在大鼠之间更换针头是最佳做法
3 ml 鲁尔锁型注射器	工具	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	试剂	GIBCO，Life Technologies 公司	14040-182
1 ml 普通尖端注射器	工具	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" 针头	工具	Fisher Scientific	14-826-48
电动无线修枝剪	工具	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	在背部抗原攻击前对大鼠进行剃毛。
使用无菌溶液、试剂和注射器。玻璃注射器和18G连接管可高压灭菌。首次操作试剂前请阅读材料安全数据表，并佩戴适当的个人防护装备。