向新生大鼠皮质脊髓神经元靶向递送病毒以研究脊髓损伤

摘要

来源：Smit, R. D., et al．利用脑部与脊柱联合手术通过双病毒载体靶向新生大鼠皮质脊髓束．J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在新生大鼠中将病毒载体靶向递送至皮质脊髓神经元的方法。该方案通过顺行性和逆行性病毒注射，实现精确的基因表达，有助于研究脊髓损伤后的神经再生与可塑性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 靶向轴突末梢的脊髓内直接注射

1. 使用玻璃注射针的尖端，通过识别脊髓动脉来大致确定脊髓的中线位置。然而，如果脊髓动脉明显偏离中心或存在任何偏移，则应通过C2棘突的位置来估算中线，并沿脊柱长度向下推断该中线位置。
   注意：将病毒溶液约5 µL加样至一片石蜡膜上，通过移液方式将病毒吸入注射器中，并将针尖置于病毒液滴上方以完成上样。
2. 确定位置后，将针尖置于C5椎板后方、接近中线的位置，并以此作为参考点。随后，使用显微操作仪将针尖向右侧横向移动0.3 mm。缓慢下放针尖直至其刚好接触脊髓表面；从此深度开始，将针尖进一步刺入脊髓0.6 mm。如有必要，可继续进针直至穿透脊髓组织，随后将针尖回撤或调整至目标深度。
3. 以250 nL/min的速度注射1 µL的逆向腺相关病毒2型-scCre（retro adeno-associated virus2-scCre）。注射完成后，等待2分钟，使病毒充分扩散进入脊髓组织，再缓慢撤出针头。在脊髓暴露范围内，于另外两个位点重复上述注射操作，注射位点的横向位置和深度坐标保持一致：一个位于中点，另一个位于T1椎板前方附近。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柔性针头连接装置	World Precision Instruments	MF34G-5	用于清洗玻璃针头并将红色油液注入玻璃针头。
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	用于拉制玻璃针头——应设计适用于纳升注射器。
带游标刻度的显微操作器	Kanetec	N/A	用于手术过程中的精确定位。
实验室标准立体定位仪	Stoelting	51600	用于固定新生动物立体定位支架。
带小鼠与新生动物适配器的实验室标准立体定位仪	51615	用于新生动物颅骨固定，适用于颅脑手术和脊髓注射。
带光源和游标目镜的显微镜	Leitz Wetzlar	N/A	用于观察和测量拉制后的玻璃毛细管形成的玻璃针头斜面。
微量注射泵控制器	World Precision Instruments	62403	用于控制注射速率。
纳升级2000泵头注射器	World Precision Instruments	500150	用于以可控方式加载和注射病毒。
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre 质粒
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (质粒 #44361)	通过 Addgene 获取自 Bryan Roth 实验室		DREADD 质粒
PrecisionGlide 针头 (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	与1 mL和10 mL注射器配合使用，用于动物模型注射。
鼠齿镊	Roboz	RS-5152	用于夹持棘突。
无菌生理盐水	Baxter Healthcare Corporation	281324	用于血液清除以及术后液体补充。
外科手套	N/A	N/A	供外科医生在手术期间使用，以维持无菌操作环境。
手术加热垫	N/A	N/A	用于维持动物模型在手术期间的体温。
手术显微镜	N/A	N/A	用于增强手术创口的可视化效果。