神经治疗学

从一名已麻醉且颅骨暴露的人类患者开始。该患者被诊断患有颅内肿瘤。在暴露的颅骨上钻孔，形成一个开口，以建立通路。在立体定向引导下，沿预定路径插入激光散射光纤（LDF）并固定到位。将患者转移至磁共振成像仪，并将激光多普勒探头连接至激光光源。从多个角度采集 MRI 图像，以观察纤维束走行及肿瘤情况。这证实了LDF位于肿瘤附近，从而能够对激光手术过程进行实时监测。设定目标热保护点，以将加热范围限制在肿瘤边界内，并保护周围组织。启动激光消融，聚焦的热能将导致肿瘤细胞死亡。达到最大消融后，停止使用激光。进行随访 MRI...

从一名被诊断为复发性胶质母细胞瘤的人类患者开始，该肿瘤具有侵袭性，其特征是肿瘤细胞浸润到周围的瘤周区域。肿瘤周围区域保留着完整的血脑屏障（BBB），其中内皮细胞之间的紧密连接限制了药物的渗透。在头皮上做切口，于颅骨上开孔，并在 MRI...

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将麻醉后的新生幼鼠置于加热垫上。用乙醇对头皮进行消毒。用含有携带药物激活型抑制性受体基因及示踪染料的腺相关病毒的病毒溶液填充注射器。将注射器针尖对准幼鼠头部，缓慢将病毒注入脑内，以确保均匀分布。让幼崽恢复。孵育期间，病毒颗粒进入神经元并将遗传物质释放到细胞核中。这会导致神经元膜上抑制性受体的表达。这些受体与离子通道相关联，但在被激活之前不会影响神经元信号传导。接下来，在数天内将目标药物皮下注射到幼鼠的颈部。该药物可穿过血脑屏障，并与抑制性受体结合。这会触发化学遗传学反应，改变离子在神经元膜上的流动，从而抑制神经元信号传导。这种化学遗传学沉默技术可模拟脑部疾病，并有助于研究异常的脑活动。...

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取一只麻醉后右侧坐骨神经暴露且完整的实验大鼠，该神经支配后肢的运动和感觉功能。切除一段神经，形成缺损，切断神经元轴突，阻断信号传导。切断的远端轴突会退化，导致特化的神经修复细胞或施万细胞脱离。将一种带有微通道的柔软管状仿生导电神经支架缝合至神经两端切断处的外层——神经外膜上。在神经末端附近植入成对电极，并将导线穿过皮肤下方引至颈部后方。施加持续的电刺激，向支架输送温和的脉冲。来自变性远端的施万细胞迁移进入支架，并沿微通道排列。这些细胞释放生长因子，刺激轴突近端的延伸。当轴突延伸时，施万细胞以富含脂质的髓鞘膜包裹它们，从而恢复信号传导。这展示了支架和电刺激在神经修复中的潜力。...

取一只经激光诱导眼内视神经乳头损伤的小鼠。这种损伤会导致供应神经的血管内皮细胞受损并形成血栓，从而减少血流，引起缺血。缺血使视神经乳头中的视网膜神经节细胞轴突失去氧气供应。在RGC细胞体中，这种破坏会损害线粒体功能并增加活性氧的产生。由此产生的氧化应激会激活凋亡信号通路，导致视网膜神经节细胞（RGC）损伤。将小鼠放入加压舱中，并使其暴露于富氧环境中。在高浓度下，氧气溶解于血浆中并扩散到缺血的神经内。作为响应，视网膜神经节细胞中的抗氧化酶被激活，以中和活性氧（ROS）。抗凋亡基因表达增加，从而增强视网膜神经节细胞的存活。此外，增加的氧气可激活血管中溶解血栓的酶。氧气还会触发血管扩张，恢复神经的血液供应。...

取多孔板中贴壁生长的小鼠小胶质细胞。向检测孔中加入聚丙烯酸包被的磁性纳米颗粒（MNPs），另一孔不加作为对照。孵育细胞，通过内吞作用使磁性纳米颗粒（MNP）被细胞摄取，从而实现其内化。用缓冲液洗涤以去除未结合的磁性纳米颗粒（MNPs）。加入酶溶液以解离细胞。将脱离的细胞转移至离心管中，离心以收集细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于基础培养基中，并将悬液转移至微量离心管。将试管置于磁性施加装置内铜线圈的中心位置。线圈产生交变磁场（AMF），而施加器保持恒定的目标温度。交变磁场与磁性纳米粒子相互作用产生热量，破坏细胞结构并触发细胞死亡通路。相比之下，不含磁性纳米粒子的对照细胞未出现热损伤。经磁热疗处理的细胞活力下降证实了由磁热疗引起的热损伤。...

将Transwell系统分为五组，进行不同的处理。第一组作为对照组，由神经母细胞瘤细胞和小胶质细胞的共培养体系组成。在第二组中，仅用纤维状β-淀粉样蛋白（fAβ）处理共培养体系。fAβ可诱导神经母细胞瘤细胞损伤。在第三组中，用808纳米激光处理神经母细胞瘤细胞，然后将其与未经处理的小胶质细胞共培养。激光可降低氧化应激，从而改善神经元存活。在第四组中，用1,064纳米激光处理小胶质细胞，然后将其与未经处理的神经母细胞瘤细胞共培养。活化的小胶质细胞增强纤维状Aβ的清除并释放细胞因子，从而保护神经母细胞瘤细胞。在第五组中，用1,064纳米激光照射小胶质细胞，用808纳米激光照射神经母细胞瘤细胞，然后将它们共培养。与单波长处理相比，双波长联合照射可显著提高神经元存活率，表明协同性光生物调节疗法具有神经保护潜力。...

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获取生物打印的骨骼肌结构。这些结构包含嵌入了肌纤维和微球的纤维蛋白水凝胶柱。微球是一种多孔聚合物结构，包裹着神经营养因子。取自鸡胚胎分离的背根神经节。将一个神经节放置于每个构建物上并进行孵育。神经营养因子以可控的生理浓度从微球中释放，促进神经元突起（称为神经突）的生长。加入固定剂以固定构建物。用缓冲液洗涤，并加入封闭液以防止非特异性抗体结合。与一抗孵育，一抗可特异性结合神经突。用缓冲液冲洗以去除未结合的抗体。加入可与一抗结合的荧光标记二抗。用缓冲液洗涤以去除过量的抗体。使用含核染料的封片剂和盖玻片封片。在共聚焦显微镜下观察神经突的生长。...

取一只已麻醉的荷瘤小鼠，剃除其头部毛发。将其放置在与聚焦超声系统集成的磁共振成像（MRI）扫描仪中。最初的磁共振成像扫描可定位脑肿瘤及邻近的血管。静脉注射造影剂，然后给予包裹在充气微泡上的荧光标记纳米颗粒。造影剂和微泡循环并到达大脑。将聚焦超声波应用于肿瘤部位。超声波使微泡扩张和收缩，从而破坏肿瘤附近血脑屏障（BBB）的紧密连接。这会在血管中形成暂时性、局部的开口，使造影剂进入，从而确认血脑屏障的破坏。微泡破裂，释放出其表面的纳米颗粒。这些纳米颗粒通过血脑屏障的开放进入脑组织，并在肿瘤及其周围区域积聚。荧光成像可追踪纳米颗粒在肿瘤区域的定位，从而深入了解纳米颗粒在神经治疗药物递送中的分布情况。...

从胶质母细胞瘤的小鼠模型开始，这是一种侵袭性脑肿瘤。在肿瘤边缘，血脑屏障（BBB）保持完整，内皮细胞形成紧密连接，调控分子的进入。小鼠佩戴有头部固定的光纤，用于递送激光。施用低强度红外激光，该激光可穿透皮肤和颅骨以到达大脑。激光激发脑细胞中的分子氧，产生活性氧（ROS）。由此产生的氧化应激会破坏紧密连接，增加血脑屏障的通透性。血脑屏障的液体渗漏会增强围绕脑细胞和血管的脑组织间液（ISF）的流动。静脉注射脂质体悬浮液，脂质体是专为药物递送设计的纳米级囊泡。脂质体穿过受损的血脑屏障，增强的脑间质液流动促进了其在肿瘤内的分布和聚集。随着时间的推移，紧密连接蛋白的表达恢复了血脑屏障的完整性，并防止进一步渗漏。...

从培养皿中浸没于人工脑脊液中的收获大鼠脑组织开始。将磁性毫米机器人放置到脑皮层上。这种名为MANiAC的毫尺度机器人由嵌入生物相容性水凝胶海藻酸盐微胶囊中的磁性取向镍纳米棒构成，并负载染料作为模型药物。将外部磁场发生器置于培养皿下方，以产生均匀的旋转磁场。镍纳米棒随着磁场排列并旋转，推动MANiAC在皮层表面移动。让MANiAC在皮层表面移动，在目标位点暂停以实现可控的药物释放。药物通过海藻酸盐胶囊扩散进入脑组织的细胞外基质，到达神经元和胶质细胞。细胞通过受体介导的内吞作用摄取药物分子。跑停式运动可确保药物在局部沉积，同时最大限度减少脱靶递送，并允许对先前治疗部位进行重复给药。...

取人单核细胞来源的类似小胶质细胞的培养物。将含有抗炎药物的纳米颗粒加入实验组培养物中，将游离药物加入对照组。这些纳米颗粒具有亲水性外壳和疏水性核心，可包载脂溶性药物。细胞通过内吞作用摄取纳米颗粒，纳米颗粒在细胞内释放药物，从而增强药物递送效果。游离药物通过被动扩散进入细胞，该过程受浓度梯度限制，导致细胞内浓度较低。添加一种可结合Toll样受体并触发促炎性细胞因子释放的细菌抗原。将实验组的培养物与含有纳米颗粒的新鲜培养基共同孵育，对照组则与游离药物共同孵育。第二次给药通过纳米颗粒递送确保了稳定的治疗药物浓度，从而诱导下游信号通路，抑制细胞因子的产生。游离药物摄取有限，导致细胞内浓度低于治疗水平。收集上清液以检测细胞因子水平，并评估纳米颗粒介导的药物递送所增强的治疗效果。...

从表达突变型α-突触核蛋白的胚胎大鼠中脑原代培养物开始，其中含有多巴胺能神经元。将处理孔中的培养基更换为含有测试化合物的新鲜培养基，对照孔中的培养基更换为不含化合物的普通培养基，然后进行孵育。在对照组中，α-突触核蛋白在多巴胺能神经元中形成毒性聚集物，导致神经突回缩，并最终引发神经元死亡。在治疗过程中，测试化合物与α-突触核蛋白相互作用，抑制其聚集，保护神经突结构，并提供神经保护作用。固定并透化细胞，然后封闭非特异性结合位点。使用一抗孵育以标记所有神经元，并对多巴胺能神经元进行额外标记。洗涤细胞，并加入针对一抗的荧光标记二抗。使用倒置荧光显微镜对不同标记的多巴胺能神经元进行计数，然后切换至共聚焦显微镜以测量神经突长度。与对照组相比，治疗组中具有完整神经突的多巴胺能神经元数量更多，证实了受试化合物具有神经保护潜力。...

从一只已麻醉且脑内含有由增殖性肿瘤细胞构成的脑肿瘤的大鼠开始。暴露大鼠的颅骨并钻孔以暴露含有肿瘤的脑区。取一种热响应性生物聚合物，该聚合物融合了细胞穿透肽和c-myc抑制剂，其中c-myc是一种致癌蛋白。将生物聚合物注入后肢的股静脉，以递送至大脑。通过颅骨孔施加红外光照射肿瘤部位，可诱导肿瘤血管周围生物聚合物聚集，并增加血管通透性。冷却该部位可使聚集体溶解，从而使生物聚合物渗过可渗透的血管壁。随后的再加热会触发重新聚集，从而将生物聚合物困于肿瘤内。加入麻醉溶液并缝合以关闭切口。肿瘤细胞通过内吞作用摄取这些聚集体，后者逃逸至细胞质中并抑制c-myc，从而阻滞细胞周期进程，抑制肿瘤增殖。...

取一只转基因的 Drosophila。Drosophila 的大脑表达人类淀粉样肽蛋白（APP）及其切割酶。该酶可切割APP，促使β-淀粉样蛋白斑块形成，从而导致阿尔茨海默病或AD病理学在 果蝇给Drosophila AD...

从一只经历大脑中动脉闭塞的大鼠开始，该手术通过暂时阻断脑组织的血液供应来实现。这会诱发缺血性中风，导致脑组织损伤。接下来，清除阻塞以恢复血流。选择表现出神经功能缺损的大鼠，以确保研究的相关性。然后，向实验组给予测试药物，同时向对照组注射生理盐水。重复给药和生理盐水给药。该试验药物可促进血管生成，从而形成新的血管。这可以增强受损脑组织的血液供应，并减轻中风的影响。接下来，麻醉大鼠并使用加热毯维持其体温。几天后，对两组进行 MRI 扫描。在 MRI...

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从一名被诊断为阿尔茨海默病并佩戴伽马疗法刺激装置的患者开始。该设备由一个眼罩和耳机组成。使用控制器启动设备，以提供听觉和视觉刺激。视觉组件以伽马频率发出闪烁的光，而听觉组件则产生同步的声音脉冲。伽马振荡是由神经元同步放电产生的脑电波，对认知和记忆至关重要。在阿尔茨海默病（AD）中，这些振荡受到破坏，导致认知功能下降。感觉诱发的伽马振荡会激活中间神经元，这些中间神经元间歇性地抑制兴奋性锥体神经元，从而促进神经元的同步放电。这种同步作用通过增加突触后末端兴奋性AMPA受体的密度来增强突触连接，这对于记忆保持至关重要。这种刺激还能增强脑部血流量，改善氧气和营养物质的供应，从而支持更佳的认知功能。此外，该刺激可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，促进β-淀粉样蛋白的清除，从而延缓阿尔茨海默病（AD）的进展。...

取一只大脑皮层发生局灶性缺血性卒中的大鼠，其血脑屏障受损、血流减少且神经元活动过度。脑卒中还会诱导星形胶质细胞活化，导致形成释放促炎性细胞因子的神经毒性星形胶质细胞。这会引发神经炎症，导致神经元和内皮细胞变性。固定大鼠，并将重复经颅磁刺激（rTMS）线圈置于缺血区域上方。连续数天给予theta-burst重复经颅磁刺激（rTMS）。电磁脉冲穿透颅骨，到达缺血区域，并刺激中间神经元释放抑制性神经递质。这些神经递质激活过度活跃神经元上的受体，诱导氯离子内流，从而抑制神经元的过度活动并减少神经元死亡。此外，这些脉冲可将神经毒性的星形胶质细胞转化为释放抗炎因子的神经保护表型，从而恢复血脑屏障的完整性。rTMS...

从一只mGluR5下游信号传导受损的转基因（GM）小鼠开始，mGluR5是一种神经递质受体。在普通小鼠的海马体中，mGluR5...

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从无接触的神经元与少突胶质细胞共培养开始。可渗透的膜将Transwell小室中的神经元与底部小室中的少突胶质细胞分隔开。向插入物中添加钾，以提高细胞外钾水平，从而抑制细胞内钾的外流。钾离子的积聚使神经元去极化，从而触发电压门控钙通道的开放，允许钙离子内流。这种内流会刺激兴奋性神经递质的释放，这些递质扩散通过可渗透膜，到达下方小室，激活少突胶质细胞上的受体，从而引起钙离子内流。钙离子浓度的升高会激活信号通路，从而诱导早期内体膜向内出芽。...

来源：Shahror, R. A. et. al., 利用磁共振成像追踪经鼻递送后在创伤性脑损伤小鼠模型中分布的超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞。J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了在小鼠模型中进行鼻内间充质干细胞（MSC）递送的方法。MSC...

来源：Quattrocolo, G., et al. 将中间神经元前体细胞同源移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

来源：Parajuli, B., et.al. 通过无创经鼻途径将人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞移植到免疫活性小鼠脑内。 J. Vis. Exp.

来源：Gonzalez-Ramos, A., 等. 将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍。J. Vis. Exp.

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp.

来源：Sharma, A. D., et.al. 用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞的高通量表征。J. Vis. Exp.

来源：Zimmermann, S.，等．富含基质血管组分的脂肪移植治疗有症状的终末神经瘤。J. Vis. Exp.

来源：Lee, Y., et.al. 将施万细胞移植至PVDF-TrFE导管内以桥接大鼠脊髓横断残端促进轴突再生。J. Vis. Exp.

来源：Palma-Tortosa, S., et.al. 成人人类皮层的类器官培养作为人类干细胞移植与验证的离体模型. J. Vis. Exp.

来源： Weber, R. Z., 等脑内移植与 在体实验 小鼠脑内人神经前体细胞的生物发光示踪 视频实验杂志...

来源：Zweckberger, K., et al. 神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用。 J. Vis. Exp.

来源：Furmanski, O., et al. 小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源的神经细胞治疗性移植. J. Vis. Exp.

来源： Ibanez-Rios, M.I., 等一种人脑类器官神经细胞移植模型。 J. Vis. Exp.