在胶质母细胞瘤小鼠模型中植入柔性生物相容性探针

摘要

来源：Lefevre, M. C., 等，用于胶质母细胞瘤脉冲电场治疗的柔性有机电子器件。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了在胶质母细胞瘤小鼠模型中植入一种柔性、生物相容性探针，以递送靶向脉冲电场治疗，用于神经治疗应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 的 体内 模型
   注意： 成年多色荧光 AMU-Neuroinflam 小鼠（B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD）被用于实验；这些小鼠中 Thy1 标记了一个亚群⁺ 通过ECFP的转基因表达标记神经元，以及利用LyzM标记外周⁺ 通过EGFP的转基因表达标记炎性细胞，并在Cd11c调控下对表达EYFP的小胶质细胞亚群进行标记⁺简而言之，在进行任何处理或注射前，先用1.5%异氟烷对动物进行2分钟的轻度镇静。手术前，采用腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）对动物实施麻醉。随后，在耳部局部涂抹3%利多卡因凝胶，以缓解固定立体定位支架时可能引起的耳部疼痛。接着，在手术部位注射0.25%布比卡因溶液，以减轻开颅所致的疼痛。待小鼠准备就绪后，进行直径为4 mm的开颅手术。使用26 G针头在开颅区域中央的硬脑膜上穿刺一个小孔，随后通过注射系统将肿瘤类球体注入。此外，如文中所述，在用玻璃窗封闭开颅部位前，将一根柔性电极放置于表达GCamp6或DsRed的肿瘤类球体上。
   1. 滴加一滴杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），使其覆盖颅骨开窗区域。将柔性电极置于DPBS液滴上，并轻轻将探针背面带有接触垫的部分放置于小鼠背部图1B).
      注意： 使用无菌手套并采用“仅接触尖端”的操作技术。若手套接触到非无菌表面，应立即更换。在操作过程中提供适当的保温支持。
   2. 用一小片纸接触DPBS液滴，吸除DPBS，直至探针能够平贴于硬脑膜并贴合脑组织曲率。确保电极下方仍保留一层薄层DPBS，且液体不从电极侧缘溢出。此举可在后续步骤中形成屏障，防止胶水溢出。
      注意： 使用前对所有设备进行灭菌。
   3. 在探针上放置少量硅胶粘合剂，并用一个5 mm的圆形盖玻片覆盖。按压盖玻片，使硅胶均匀分布，并使盖玻片与探针之间的距离最小化。继续按压盖玻片30秒，使硅胶固化。
   4. 为固定盖玻片，迅速在其侧面涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并向下按压，直至胶水固化变硬。
   5. 用牙签将超级胶水涂抹在探针的颈部，注意将胶水涂抹到颈部下方，以提供稳固的支撑。
   6. 用牙科水泥覆盖颅骨以构建慢性帽。需特别注意，仅覆盖盖玻片的边缘。
   7. 抬起探针的后部，在其颈部下方涂抹胶水。在胶水固化前将探针放置于胶水上。用钝头镊子轻轻下压探针颈部，使其表面与盖玻片表面齐平，确保在实验过程中不妨碍显微镜物镜的操作。
   8. 用牙科水泥在探头颈部顶端覆盖不超过1.5 mm的薄层，以牢固固定探头。在盖玻片周围1–2 mm处构建水泥围堰，形成一个高约1.5 mm的环形凸起，用于容纳双光子成像所需的浸没液，形成浸液 basin。图1C).
   9. 水泥固化后，皮下注射布托啡诺术后镇痛剂（0.05 mg/kg，每10 g体重注射0.1 mL），并将动物置于温暖环境中直至苏醒。可将动物置于红外灯泡附近，并用纸巾包裹以保温。
      注意： 将温度计置于小鼠所在水平位置以监测温度。
   10. 使用电化学工作站表征1-10 kHz范围内的阻抗。
   11. 让动物术后恢复至少10天。手术后立即给予抗炎药物，并持续监测动物状态，以提供适当的术后镇痛。

结果

图1：体内应用。in vivo实验示意图。（A）in vivo 实验示意图。（B）盖玻片和丙烯酸树脂应用前的探针放置位置。（C）探针植入完成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酸树脂	Fischer scientific	NC1455685
丁丙诺啡	Axience
实验室自制脉冲发生器
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
磷酸盐缓冲液	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
直径5 mm的圆形盖玻片	Fischer scientific	50-949-439
硅胶粘合剂Kwik-Sil	World Precision Instruments
超级胶水	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14	人胶质母细胞瘤细胞