深部脑刺激作为大鼠模型中药物成瘾的治疗方法

摘要

来源：Batra, V., 等 深部脑刺激对静脉内甲基苯丙胺自我给药影响的通用评估方法。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种大鼠药物成瘾模型，其中动物通过按压杠杆自行注射静脉内甲基苯丙胺，导致由伏隔核多巴胺释放驱动的强迫性觅药行为。为对抗这一行为，大鼠接受通过植入式双极电极进行的深部脑刺激（DBS），以高频脉冲抑制伏隔核中过度活跃的神经元。随后通过观察觅药行为的变化来评估DBS的效果，揭示其在减轻成瘾相关反应方面的潜力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 啮齿类动物适应性饲养与食物限制

1. 实验开始时使用3月龄的成年Wistar大鼠。将大鼠单独饲养于配备层流装置和空气过滤器的笼具中，置于温度和湿度受控、经美国实验动物照护评估认证协会（AAALAC）认证的动物实验设施内，采用倒置的12小时光照/黑暗循环（光照关闭时间为0600时）。
2. 自由供应水和标准啮齿类动物饲料，直至大鼠体重达到约380–400 g。随后限制进食，使大鼠在实验期间维持在其自由进食体重的85%至90%，以促进对甲基苯丙胺反应的习得与维持。
3. 从大鼠到达之日起至整个实验期间，每天在饲养笼所在房间内进行操作，记录体重并调整每日食物供给量。
4. 当达到目标体重后，准备为每只大鼠手术植入慢性留置颈静脉导管和颅内刺激电极。

2. 颈静脉插管

1. 导管制备
   1. 准备一段长度为13 cm、内径为0.012 × 0.025英寸的硅胶管，在距一端4 cm处使用额外的硅胶管和电灼器制作一个硅胶球，并静置风干。
   2. 将管子的另一端浸入由柑橘提取的柠檬烯基溶剂中数分钟，使其膨胀。将膨胀后的管子连接至一个呈直角弯曲的不锈钢导向套管。
   3. 使用牙科丙烯酸树脂水泥将不锈钢导向套管的弯曲底部固定在一块1英寸见方的生物相容性网状材料上。
   4. 用乙醇和蒸馏水冲洗导管内外，通过管路注入空气以去除残留液滴。静置过夜（O/N）干燥。
2. 无菌操作
   1. 所有手术均应在专用的动物手术室中进行，并采用无菌外科技术。使用高压灭菌器对器械和植入物进行灭菌，并通过在手术台（OR台）上铺设防水纸并覆盖无菌巾来准备无菌区域。
   2. 佩戴无菌手套，在操作过程中将所有器械、植入物和外科纱布置于无菌区域内。在进行多台手术时，每次操作之间需用酒精棉片擦拭每件器械，随后在干热灭菌珠中处理20秒。
3. 麻醉
   1. 术前给予大鼠阿托品（硫酸盐）（0.04 mg/kg，皮下注射），随后给予戊巴比妥钠（20–50 mg/kg，腹腔注射）以实现麻醉。
   2. 手术前立即注射无菌普鲁卡因青霉素G混悬液（75,000单位，肌内注射[i.m.]）和镇痛剂（卡洛芬，5–10 mg/kg，皮下注射或酮洛芬，2–5 mg/kg，皮下注射），分别用于减少围手术期感染和疼痛。
   3. 通过轻捏动物脚趾检查麻醉是否充分，若无反应即可继续操作。双眼涂抹眼用润滑剂。
4. 手术部位准备
   1. 在大鼠背部肩胛连线后方剃除一块2 × 2 cm的背侧毛发区域，在右侧颈部下颌骨与胸骨之间剃除一块1 × 1 cm的腹侧毛发区域。
   2. 用酒精棉片擦拭剃毛区域，再用聚维酮碘溶液擦拭。将大鼠置于无菌巾上，待聚维酮碘干燥后再进行下一步操作。
5. 导管植入
   1. 使用10号刀片在背部肩胛间中线区域沿肩胛连线平行方向做一切口。使用止血钳分离皮肤与下方结缔组织，为网状导管基座创建一个皮下平面。用无菌生理盐水冲洗术区，并用无菌纱布覆盖，在将大鼠翻转为仰卧位前完成此步骤。
   2. 使用10号刀片在右侧下颌骨与胸骨之间做一斜切口。使用止血钳分离皮肤与下方结缔组织以定位颈外静脉。
      注意：颈外静脉呈白色/银色、有光泽，在雄性大鼠中比雌性更大。
   3. 将刮匙置于静脉下方，在暴露静脉的近端（上方）轻轻结扎一根4-0丝线缝合线，然后将静脉推回颈部。
   4. 分离结缔组织，在颈部皮肤下外侧浅层但肌肉上方创建一个皮下袋。将已灭菌的穿刺针从颈部切口经臂后方向肩胛中部切口穿行。将硬质导丝从颈部端穿过穿刺针插入并进入远端导管，再从背部将导管引至颈部；将导丝从颈部切口拉出时，连接的远端导管将随之被拉出。
   5. 通过牵拉先前放置的近端缝线，将右颈外静脉提起并置于刮匙上方进行隔离。使用圆头剪刀在静脉上方做一小段部分切口。
   6. 将弯头镊子插入静脉切口以扩大开口。保持镊子张开并固定位置，将导管尖端从镊子尖端之间插入静脉约2–3 cm，使其末端终止于右心房外。
   7. 用4-0丝线缝合线结扎远端静脉以固定导管。将近端和远端缝线打成“方结”以增强稳定性。
   8. 用肝素化无菌生理盐水冲洗导管，并回抽血液以确认植入成功。将缝线在结扎结上方1–2 mm处剪断，将剩余的近端导管埋入颈部皮下。使用合适的缝合方法或技术关闭切口。若使用不可吸收缝线或缝钉，需在术后10–14天在全身麻醉下拆除。使用无菌棉签涂抹抗生素软膏覆盖切口。
   9. 使用可吸收缝线在网状基座相对的两个角处将其远端导管/导向套管/网状组件固定于背部皮下组织。围绕导向套管使用间断、非内翻的可吸收缝线关闭背部切口。使用无菌棉签涂抹抗生素软膏覆盖切口。
6. 术后护理
   1. 使用3 ml注射器以肝素化0.9%无菌生理盐水冲洗导管，并将堵头插入导向套管以防止堵塞。
   2. 每日对每只大鼠的导管进行一次冲洗，以维持通畅性。
   3. 操作完成后立即将大鼠放回其饲养笼中，并置于手术室内的加热垫上，观察直至意识恢复并出现自主活动。
   4. 待大鼠恢复后送回动物房，等待5至7天后再进行颅内手术。每日称重、抓取并评估其总体状况，包括检查是否有感染迹象以及动物行为、外观和活动水平。
   5. 如出现任何问题，应咨询动物资源中心兽医，并遵循其推荐的治疗方案。根据需要注射镇痛剂（卡洛芬，5–10 mg/kg，皮下注射或酮洛芬，2–5 mg/kg，皮下注射）以缓解围手术期疼痛。

3. 颅内电极放置

1. 手术准备
   1. 按照第2.2节所述，在无菌条件下进行所有手术操作。
2. 麻醉
   1. 将动物放入麻醉诱导室，并以1,000 - 2,000 ml/min的流速向室内输送异氟烷气体，挥发罐设定为5%。
   2. 当动物呈侧卧状态后，将其从诱导室中取出，并置于立体定位手术平台上的鼻罩中。将气体从诱导室切换至鼻罩，挥发罐设定为2 - 3%，继续供气。
   3. 根据需要调整挥发罐设置，以维持稳定的呼吸频率，并确保手术期间对刺激无反应。
   4. 在手术开始前立即肌肉注射青霉素G普鲁卡因混悬液（75,000单位，i.m.），并皮下注射镇痛剂（布托啡诺 0.05 至 0.5 mg/kg sc），分别用于减少围手术期感染和疼痛。
   5. 通过轻捏动物脚趾进行中等强度刺激，检查麻醉是否充分；若无反应，则继续操作。同时为双眼涂抹眼用润滑剂。
3. 手术区域准备
   1. 剃除大鼠头部顶部毛发，并将其头部固定于耳杆中，以确保手术过程中头部保持不动。先用酒精棉片擦拭剃毛区域，再使用聚维酮碘溶液涂抹，待聚维酮碘自然干燥后再继续操作。
4. 电极植入
   1. 用镊子夹住两耳之间略偏前方的头皮，使用剪刀横向剪开基底部，从而移除颅顶中部约1.5 × 1 cm的皮肤区域。
   2. 使用10号刀片在颅骨膜上做环形切口直至暴露颅骨，再用弯头镊刮除并清除颅骨膜。用无菌生理盐水冲洗术区，用纱布吸除多余血液和盐水，并使颅骨完全干燥，以便清晰观察包括前囟在内的骨性标志。
   3. 对于双侧手术，将两个双极铂铱电极分别安装至立体定位手术平台两侧的电极夹持器中。将第一个电极移动至前囟上方约1 mm处，记录数字显示屏上显示的前后（AP）和内外侧（ML）立体定位坐标。切勿让电极尖端实际接触颅骨，以免导致电极失效。对另一侧电极重复此操作。
   4. 根据目标脑区结构计算最终的AP和ML坐标。将电极移至该位置，使其尖端刚好位于颅骨上方，读取数字显示屏上的初始背腹向（DV）坐标。再根据目标脑区结构确定最终的DV植入深度。
      注意： 本示例中靶向伏隔核壳部（nucleus accumbens shell），因其已知参与药物摄取行为，所用相对于前囟的立体定位坐标如下：AP入点坐标 = [前囟处数字显示坐标] + 1.6ML入点坐标 = [前囟处数字显示坐标] ± 2.4（右/左）DV深度 = [AP/ML入点处颅骨表面数字显示坐标] - 8.5
   5. 用永久性记号笔在颅骨表面标记每个电极的预计进入位置。操作过程中切勿碰撞或触碰电极尖端。
   6. 使用圆形金刚砂钻头在每个标记处钻出直径1.4 mm的孔。操作高速钻时需小心，避免穿透颅骨进入颅腔。钻孔完成后，使用弯头镊刺破硬脑膜。
   7. 在电极植入位点后方额外四个位置使用圆形金刚砂钻头钻出直径0.7 mm的孔，用于植入颅骨螺钉。使用手动螺丝刀将四枚规格为0.8（直径）× 3.2（长度）mm的不锈钢螺钉旋入颅骨，中线两侧各两枚。将螺钉牢固旋入颅骨，深度约为其总长度的一半，因为这些螺钉将成为未来数周至数月内固定颅骨帽的主要支撑结构。
   8. 通过手动旋转控制电极夹持器Z坐标的手轮，将第一个电极缓慢插入脑组织至计算所得的DV深度。旋转速度应控制在约每秒半圈，以防止对电极尖端造成过度损伤。确保电极进入脑组织时尖端不接触钻孔的骨缘。
   9. 使用瞬干胶覆盖钻孔及后方螺钉以固定第一个电极，随后覆盖牙科水泥。待该结构完全干燥后，将电极从夹持器中取出。对第二个电极重复插入和固定过程。牙科水泥应涂抹至紧贴皮肤边缘，但不得覆盖皮肤，否则会从长期影响颅骨水泥帽的稳定性。
5. 术后护理
   1. 在电极基座上安装两个防尘帽，防止堵塞。
   2. 手术结束后立即将大鼠放回其饲养笼中，并置于手术室内的加热垫上，持续观察直至意识恢复并出现自主活动。
   3. 待动物恢复后将其送回动物房，并在开始实验前留出五天恢复期。每日称重、抓取并评估大鼠的一般状况，包括检查是否有感染迹象，以及观察动物行为、外观和活动水平。
   4. 若出现任何异常情况，应及时咨询动物资源中心兽医，并遵循其建议的治疗方案。根据需要皮下注射镇痛剂（布托啡诺 0.05 至 1 mg/kg sc）以缓解围手术期疼痛。由于非甾体类镇痛药（如卡洛芬 carprofen，5 - 10 mg/kg，sc 或酮洛芬 ketoprofen，2 - 5 mg/kg，sc）可能增加颅内出血风险，因此颅内手术围手术期应优先选用布托啡诺作为镇痛药物。

4. 操作性实验装置

1. 使用置于隔音箱内的塑料和不锈钢操作式条件反射箱进行行为学实验。
2. 在每个隔音箱内配备排气扇，以提供通风并产生白噪音，屏蔽外界干扰声音。
3. 使用个人计算机和行为学软件接口系统来编程实验程序并收集实验数据。
4. 通用设置
   1. 在每个实验箱的一侧壁上安装两个反应杠杆，每个杠杆上方设有刺激灯。将其中一个杠杆设为“活动”杠杆，使其在被按压时产生程序设定的结果。
   2. 编程控制位于活动杠杆正上方的刺激灯，在每次操作式实验期间点亮，表示药物可获得。
   3. 在活动杠杆上的一次有效反应将触发一次甲基苯丙胺输注（0.05 mg/kg/次，溶于100 µl 0.9% NaCl溶液中，持续2.8秒），同时对面墙壁的箱内灯亮起5秒，且刺激灯熄灭，进入30秒的超时阶段。
   4. 记录活动杠杆上的反应次数，但在30秒超时期间不给予任何程序设定的后果。为完整记录，同时记录非活动杠杆上的反应，但该杠杆反应不产生任何程序设定的后果。

5. 静脉（IV）甲基苯丙胺自我给药实验步骤

1. 常规准备
   1. 尽快且平稳地将大鼠放入操作箱中，以尽量减少行为干扰。将不锈钢弹簧 leash 连接到大鼠背部的导管套管上，并连接至悬挂在操作箱上方的无泄漏液体旋转接头。
   2. 确保从旋转接头到位于隔音箱外的电机驱动泵中20 ml 药物注射器之间的连接管路完整无损。为此，需将塑料连接管至少推进¼英寸至金属旋转接头端部和药物注射器针头端部，直至在适度拉扯下不会滑脱。对旋转接头和 leash 组件进行配重平衡，以允许动物相对自由地活动。
   3. 每周一至周五，每天在大致相同的时间进行操作任务实验。
2. 习得阶段
   1. 为促进大鼠快速习得静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为，连续四到五天每天进行6小时的实验。
   2. 采用固定比率 FR-1 + 30 秒超时强化程序进行实验，即大鼠每按压一次有效杠杆，即可获得一次静脉注射甲基苯丙胺，随后进入30秒超时期（例如，在此期间按压任一杠杆均不会触发提示信号或奖励）。
      注意：这种初始阶段长时间且“容易”的药物获取机会，将使大多数大鼠在不超过一周的时间内建立起显著的药物摄取行为（图3）。
3. 维持阶段
   1. 训练的第二周，每周一至周五每天进行2小时实验，以维持并优化静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为。
   2. 继续采用固定比率 FR-1 + 30 秒超时的强化程序进行实验。
   3. 当连续三个实验阶段中，每次会话内甲基苯丙胺给药次数的总变化幅度小于10%（图4），且前30分钟内的累积输注次数大于后30分钟内的累积输注次数时（图5），可视为已建立稳定且强烈的操作反应。
      注意：该标准可确保大鼠在会话初期形成药物集中摄取模式，表明其已出现成瘾性行为19，而非随意使用。
4. 实验后处理
   1. 每次实验结束后，将 leash 从大鼠背部断开。用含有800 IU 链激酶的0.1 ml 0.9%生理盐水冲洗导管，以防血液凝结。在每个导管套管中插入堵头，防止堵塞，然后将大鼠放回饲养笼中。
   2. 在整个实验过程中，每周三实验结束后立即检测导管通畅性。
      1. 准备一支装有肝素化抑菌生理盐水的3 cc 注射器（配备22 G 针头），用于检测导管通畅性。将一段4至6英寸长的塑料管一端连接到针头上，另一端连接到动物背部导管-套管组件的金属接口上。
      2. 注入0.1至0.2 ml生理盐水以确认液体流通顺畅，然后回抽注射器活塞。若导管通畅，则应能轻松冲洗并回抽出血液，血液可见于管路中。松开活塞，再注入0.2 ml生理盐水，将所有血液冲洗回导管内。
      3. 若无法抽出血液，则将3 cc 注射器和管路从金属接口上移除。
      4. 准备一支装有速效麻醉剂甲戊巴比妥钠的1 cc 注射器（配备22 G 针头），进一步检测导管通畅性。将一段4至6英寸长的塑料管一端连接到针头上，另一端连接到动物背部导管-套管组件的金属接口上。
      5. 注入1.5 mg后迅速将1 cc 注射器和管路从动物背部金属接口上移除。重新连接装有肝素化抑菌生理盐水的3 cc 注射器，并注入0.1 - 0.2 ml。若动物在3秒内失去肌肉张力，则表明导管通畅且功能正常。
5. 参见补充文件“常见问题”部分，了解有关甲基苯丙胺不良反应、未能建立自我给药行为以及大鼠取出困难等问题的说明。

6. 脑刺激装置

1. 使用10至12个亚克力板箱（12英寸×18英寸×18英寸）（宽×高×深）进行DBS实验。在每个箱子的外侧覆盖坚固的不透明纸，遮住箱子的背面和侧面，以防止大鼠相互观察或互动。保持透明的前面板裸露，以便实验人员在刺激期间观察动物。
2. 用半透性面板覆盖箱子的顶部，以防止大鼠逃逸，同时允许空气流通。利用该面板支撑位于每个箱子上方的换向器，以实现啮齿类动物头帽与刺激系统之间的电连接。
3. 使用能够向多只动物同时提供恒定电流刺激的刺激系统进行DBS实验。该系统应包含用户可编程的数字信号处理器/通信接口、刺激器、刺激器电池组、通道分路盒及配套软件（参见材料清单）。
4. 使用定制长度的电缆将刺激器的通道端口连接到每个换向器的上部电子基座。
   注意： 所需长度取决于各个实验室的具体情况。这些电缆位于动物区域之外，无需用不锈钢弹簧包裹。
5. 使用外覆不锈钢弹簧的16英寸电缆，将集电环的下部电子底座与啮齿类动物颅骨帽上植入的电极底座连接。确保电缆长度足以让动物在围栏内任何区域自由活动，且不会对颅骨帽产生明显张力。
   注意： 一根电缆的末端大致位于大鼠四肢站立时头部所在的位置通常就足够了。
6. 脑刺激编程
   1. 使用个人计算机和编程软件来设定刺激参数（例如， 波形、频率、脉冲宽度、刺激间延迟、电流幅度）并采集实验数据。
   2. 使用可视化编程语言，指定每个设备为实现实验终点所需执行的功能，以及将存储和/或实时显示的数据。本项目所运行的指令在下文中展示。 图1.
   3. 在可视化控制面板中指定所需的频率、脉冲宽度和振幅图2实验开始前）。大鼠高频刺激的典型参数与临床人体深部脑刺激所用参数相似：频率为130至180 Hz，脉宽为60至90 msec，电流强度为100至250 μA4,8-10。
      注意由于啮齿类动物体型较灵长类动物小，因此使用较低的电流。

7. 脑深部电刺激手术步骤

1. 将大鼠装入箱中时，将旋转连接器的不锈钢弹簧电缆连接到头帽的每个电极基座上。通过在1,000 Hz频率下施加5 μA电流持续2秒，测试每个电极的阻抗。
   1. 如果阻抗小于或等于125 KOhm，则可继续进行实验，因为电极能够提供有效的治疗性刺激。如果阻抗大于125 kOhms，则应考虑将该动物排除出实验，因其电极的高电阻可能导致电流降低至可能无效的治疗水平。
2. 让大鼠进行一到两次模拟训练以适应环境，在此期间它们将连接电极电缆但不接受任何主动治疗。模拟测试可消除任何非特异性的行为影响。每次模拟训练结束后，立即将大鼠转移至操作箱中进行每日2小时的静脉甲基苯丙胺自我给药实验。
3. 将大鼠均衡分配为两组：一组为接受主动刺激的实验组，另一组为接受假刺激的对照组，确保两组之间的基础药物摄入量无显著差异。
4. 对啮齿类动物群体进行为期5天的每日深部脑刺激（DBS）实验，根据分组情况，每组分别接受3小时的主动电刺激或无刺激。每次DBS实验结束后，立即将大鼠转移至操作箱中进行每日2小时的静脉甲基苯丙胺自我给药实验。
   1. 在每次DBS实验期间至少观察部分时间段，仔细监测动物，确保刺激未引起明显的行为改变。若在刺激期间或之后出现任何异常行为，应详细记录这些观察结果。注意：本文所述实验中，作者未观察到显著的行为改变或食物/饮水摄入量的变化。
5. 根据研究假设，可调整DBS治疗的持续时间、电学参数以及DBS实验与操作行为实验之间的时间间隔。

结果

图1. 可视化编程语言。 研究人员使用可视化编程语言（如此处所示示例），设计可在用户输入参数下同时向多个动物传递脑刺激的程序。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啮齿类动物操作箱	Med Associates, Inc	ENV-008CT	Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA 电话: (802) 527-2343
带数字显示控制台的 Kopf 小动物立体定位仪	Kopf Instruments	型号 940	Kopf 电话: 1-877-352-3275 传真: 1-818-352-3275 邮箱: sales@kopfinstruments.net
Z系列 3-DSP 生物放大处理器	Tucker Davis Technologies	RZ5D	Tucker-Davis Technologies 11930 Research Circle Alachua, FL 32615 USA 电话: 386-462-9622 www.tdt.com
Z系列 32通道刺激器	Tucker Davis Technologies	IZ2-32	软件附带用户手册，介绍如何使用 OpenEx 平台编程实验，可通过以下链接访问：http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdf
IZ2 刺激器用 48 伏锂离子电池组	Tucker Davis Technologies	LZ48-200
PZ5 用 32通道分路盒	Tucker Davis Technologies	S-BOX_PZ5
多通道神经记录用 OpenEx 扩展软件包	Tucker Davis Technologies	OpenEx
铂铱合金刺激电极	Plastics One Inc	MS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005"	Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, 电话: 540-772-7950
刺激器与换向器之间的双通道电缆	Plastics One Inc	305-441/2 W/ Spring
换向器与电极基座之间的双通道电缆	Plastics One Inc	305-305 W/ Spring
四通道换向器	Plastics One Inc	SL2+2C 和 SL2+SC/SB