来源：Palma-Tortosa, S., et.al. 成人人类皮层的类器官培养作为人类干细胞移植与验证的离体模型. J. Vis. Exp. (2022)
本视频演示了将干细胞来源的神经前体细胞移植到人脑皮层组织切片中的过程。该操作包括将前体细胞从基底膜基质中分离并重悬，随后将其注射至置于Transwell培养系统上的皮层切片中。经过孵育以使基质凝固并促进神经元分化后，对移植后的组织进行后续分析的制备。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
将干细胞来源的神经祖细胞移植至人脑皮层切片
519 次观看
⸱
2025年8月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. lt-NES 细胞的增殖与分化
注意：人诱导多能干细胞来源的长期自我更新神经上皮样干细胞（lt-NES）通过携带绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体进行转导，该载体由组成型启动子驱动（GFP-lt-NES细胞）。每管含有3 × 106个细胞，保存于−150 °C，待用。
1. 储备液和培养基的配制
1. 将100 µg碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）-0.1%牛血清白蛋白（BSA）中，配制成10 µg/mL的储存液。分装为100 µL每份。
2. 将100 µg表皮生长因子（EGF）溶于10 mL PBS-0.1% BSA中，配制成10 µg/mL的储存液。分装为100 µL每份。
3. 将50倍B27添加剂分装，每份体积为100 µL。
4. 将10 mg多聚-L-鸟氨酸溶于100 mL去离子水中，配制成100 µg/mL的储存液，分装为每份1 mL。
5. 准备 30 µL 的 1.20 mg/mL 小鼠层粘连蛋白等分试样。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
表1：lt-NES细胞增殖培养基（基础培养基）的成分。
| 基础培养基 | 储存浓度 | 终浓度 | 每 100 mL 添加量 |
| 含 L-谷氨酰胺的 DMEM/F12 | 1x | 98.7 mL | |
| N-2 添加剂 | 100x | 1:100 | 1 mL |
| 葡萄糖 | 45% | 3.5 mL/L | 350 µL |
表2：lt-NES细胞的分化定义培养基（DDM）成分。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人新皮质组织的维持与培养 | |||
| 6孔板 | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex 支架 6 孔插入式培养板 | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 添加剂（50倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| 无酚红 BrainPhys 培养基 | StemCell Technologies | #05791 | 文中称为神经元培养基 |
| 250 mL 或 500 mL 滤器单元 | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| 镊子 | 任何适用型号 | ||
| 庆大霉素（50 mg/mL） | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax 添加剂（100倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 文中称为 L-谷氨酰胺 |
| 橡胶吸头 + 玻璃移液管 | 任何适用型号 | ||
| lt-NES 细胞的生成 | |||
| 2-巯基乙醇（50 mM） | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 无动物成分重组 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 添加剂（50倍浓度） | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| 牛血清白蛋白 V 组分（7.5% 溶液） | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| 环杷明（Cyclopamine），来自 Veratrum californicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D-(+)葡萄糖溶液（45%） | Sigma | G8769 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 培养基 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | 不含钙和镁 |
| 小鼠天然层粘连蛋白（Laminin Mouse Protein, Natural） | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 添加剂（100倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| 多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-Ornithine） | Merk | P3655 | |
| 重组人 BMP-4 蛋白 | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| 重组人 Wnt-3a 蛋白 | R&D Systems | 5036-WN | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂，粉末状 | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| 无菌去离子水 | MilliQ | MilliQ 滤水系统 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Sigma | T4049-500ML | |
| 细胞培养设备 | |||
| 可调移液器（10、100、200、1000 µL） | Eppendorf | Various | |
| 适用于胚胎干细胞的基底膜基质（Matrigel） | Corning | CLS354277-1EA | |
| 离心机 | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2，37 °C |
| 培养箱 | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| 干细胞切割工具（0.190–0.210 mm） | Vitrolife | 14601 | |
| 无菌离心管 | Sarstedt | Various | |
| 无菌一次性玻璃巴斯德移液管（150 mm） | VWR | 612-1701 | |
| 无菌移液器吸头（0.1–1000 µL） | Biotix VWR | Various | |
| 无菌血清移液管（5、10、25、50 mL） | Costar | Various | |
| T25 培养瓶（Nunc） | ThermoFisher Scientific | 156367 |
