将干细胞来源的神经祖细胞移植至人脑皮层切片

摘要

来源：Palma-Tortosa, S., et.al. 成人人类皮层的类器官培养作为人类干细胞移植与验证的离体模型. J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了将干细胞来源的神经前体细胞移植到人脑皮层组织切片中的过程。该操作包括将前体细胞从基底膜基质中分离并重悬，随后将其注射至置于Transwell培养系统上的皮层切片中。经过孵育以使基质凝固并促进神经元分化后，对移植后的组织进行后续分析的制备。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. lt-NES 细胞的增殖与分化

注意：人诱导多能干细胞来源的长期自我更新神经上皮样干细胞（lt-NES）通过携带绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体进行转导，该载体由组成型启动子驱动（GFP-lt-NES细胞）。每管含有3 × 10⁶个细胞，保存于−150 °C，待用。

1. 储备液和培养基的配制

1. 将100 µg碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）-0.1%牛血清白蛋白（BSA）中，配制成10 µg/mL的储存液。分装为100 µL每份。

2. 将100 µg表皮生长因子（EGF）溶于10 mL PBS-0.1% BSA中，配制成10 µg/mL的储存液。分装为100 µL每份。

3. 将50倍B27添加剂分装，每份体积为100 µL。

4. 将10 mg多聚-L-鸟氨酸溶于100 mL去离子水中，配制成100 µg/mL的储存液，分装为每份1 mL。

5. 准备 30 µL 的 1.20 mg/mL 小鼠层粘连蛋白等分试样。

6. 将10 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（0.25%）用90 mL磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，得到0.025%的储存浓度。分装成每份1 mL。

7. 将 0.025 g 胰蛋白酶抑制剂溶于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 0.5 mg/mL 的储存液。分装为每份 1 mL。

8. 将10 µg Wnt3a（Wingless型MMTV整合位点家族成员3A）溶于1 mL PBS-0.1% BSA中，配制成10 µg/mL的储存液。以相同方法配制BMP4（骨形态发生蛋白4）。分装为每份100 µL。

9. 将1 mg环杷明溶于2.5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为400 µg/mL的溶液，并分装为100 µL每份。

10. 准备基础培养基（表1）和分化限定培养基（DDM，表2），并在4 °C下保存，最长可保存2周。

2. 培养皿包被

1. 为了在增殖或分化期间培养GFP-It-NES细胞而预先包被培养皿，需用去离子水将多聚-L-鸟氨酸按1:100稀释，并向T25培养瓶中加入5 mL该溶液。于室温（RT）孵育过夜。

2. 用去离子水清洗一次聚-L-鸟氨酸包被的培养板，再用 PBS 清洗一次。

3. 对于处于增殖状态的GFP-It-NES细胞，将小鼠层粘连蛋白以1:500的比例溶于PBS中，37 °C孵育至少2小时。对于处于分化状态的GFP-It-NES细胞，将小鼠层粘连蛋白以1:100的比例溶于PBS中，37 °C孵育至少2小时。

3. GFP-lt-NES 细胞的增殖

1. 在两个不同的 15 mL 离心管中，分别预热 5 mL（用于洗涤）和 5 mL（用于接种）基础培养基。

2. 在 37 °C 下快速解冻一管 GFP-lt-NES 细胞，转移至洗涤管中，并在 300 × g 下离心 5 分钟。

3. 小心吸除上清液，避免接触沉淀，将细胞重悬于1 mL预热的基础培养基中。将细胞悬液转移至含有添加了增殖因子的基础培养基的接种管中：EGF（10 ng/mL）、bFGF（10 ng/mL）和B27（10 ng/mL）。将细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的T25培养瓶中。

4. 每天用增殖因子喂养细胞。如果培养基变黄，则更换培养基。每三天或四天传代一次细胞（细胞达到100%融合度后的第一天进行传代）。

4. 分离 GFP-lt-NES 细胞用于增殖与分化

1. 每瓶加入 5 mL 预热的基础培养基（用于收集细胞），另准备重新接种所需的全部培养基体积。
注意： 传代时采用 1:3 稀释比例以维持细胞增殖，需 15 mL 基础培养基；采用 1:6 稀释比例以启动分化，需 30 mL 基础培养基。

2. 用抽吸法移除细胞培养瓶中的培养基，加入 500 µL 预热的 0.025% 胰蛋白酶。在室温下孵育 5–10 分钟。可在标准光学显微镜下以 10 倍物镜观察确认细胞是否已脱落。

3. 加入等体积的胰蛋白酶抑制剂（终浓度为 0.5 mg/mL），随后加入 5 mL 温热的基础培养基。通过轻柔吹打使细胞脱离并收集细胞。将细胞转移至 15 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。

4. 为维持细胞增殖，以1:3的比例将细胞传代至含有增殖因子的新鲜基础培养基中，并重复步骤 1.3.4.

5. GFP-lt-NES 细胞的皮层分化

1. 第0天，将用于分化的细胞重悬于30 mL添加了增殖因子的基础培养基中，并接种至六瓶经分化包被处理的T25培养瓶中（按1:6比例传代）。

2. 第1天，更换一半培养基为DDM，并加入半浓度的增殖因子。

3. 第2天，将培养基完全更换为添加了分化因子的DDM：BMP4（10 ng/mL）、Wnt3a（10 ng/mL）和环杷明（cyclopamine，400 ng/mL）。

4. 第4天，仅加入分化因子。如果培养基变黄，则更换培养基。

5. 第6天，将培养基更换为添加了BMP4和Wnt3a的DDM。此步骤中去除环杷明（cyclopamine）。

6. 第7天，按照步骤 1.4.2 和步骤 1.4.3 所述方法消化细胞。

2. 将GFP-lt-NES细胞移植到类器官人脑皮层切片中

注意： 成人人类皮层（hACtx）组织应在细胞移植前培养1周。为便于移植操作，需从插入物顶部移除2 mL hACtx培养基，以防止组织漂浮。

1. 将皮层预处理的 GFP-lt-NES 细胞（来自步骤 1.5.6）重悬于冷的纯基底膜基质（参见材料表）中，细胞浓度为 1 × 10⁵ 个细胞/µL，并将悬液转移至较小的无菌管中。

注意：在移植过程中，所有材料（移液器吸头、管子、毛细管等）均应预先冷却，以防止凝胶固化。使用前需将基底膜基质凝胶在冰上解冻30分钟。

2. 将细胞悬液收集到连接有橡胶吸头的冷玻璃毛细管中，通过刺入半干燥的组织切片不同位点，以约1 µL的小液滴形式注入细胞悬液。

3. 将凝胶在37 °C孵育30分钟使其凝固。将培养板从孵育箱中取出并放回生物安全柜中，小心地向插入物顶部加入2 mL hACtx培养基，以完全浸没组织。

4. 每周更换一次新鲜的hACtx培养基。

结果

表1：lt-NES细胞增殖培养基（基础培养基）的成分。

基础培养基	储存浓度	终浓度	每 100 mL 添加量
含 L-谷氨酰胺的 DMEM/F12	1x		98.7 mL
N-2 添加剂	100x	1:100	1 mL
葡萄糖	45%	3.5 mL/L	350 µL

表2：lt-NES细胞的分化定义培养基（DDM）成分。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人新皮质组织的维持与培养
6孔板	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex 支架 6 孔插入式培养板	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 添加剂（50倍浓度）	ThermoFisher Scientific	17504001
无酚红 BrainPhys 培养基	StemCell Technologies	#05791	文中称为神经元培养基
250 mL 或 500 mL 滤器单元	Corning Sigma	CLS431096/97
镊子	任何适用型号
庆大霉素（50 mg/mL）	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax 添加剂（100倍浓度）	ThermoFisher Scientific	35050061	文中称为 L-谷氨酰胺
橡胶吸头 + 玻璃移液管	任何适用型号
lt-NES 细胞的生成
2-巯基乙醇（50 mM）	ThermoFisher Scientific	31350010
无动物成分重组 EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 添加剂（50倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
牛血清白蛋白 V 组分（7.5% 溶液）	ThermoFisher Scientific	15260037
环杷明（Cyclopamine），来自 Veratrum californicum	Calbiochem	# 239803
D-(+)葡萄糖溶液（45%）	Sigma	G8769
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12 培养基	ThermoFisher Scientific	11320074
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Thermo Fisher Scientific	14190-144	不含钙和镁
小鼠天然层粘连蛋白（Laminin Mouse Protein, Natural）	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM 非必需氨基酸溶液（100倍浓度）	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 添加剂（100倍浓度）	ThermoFisher Scientific	17502001
多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-Ornithine）	Merk	P3655
重组人 BMP-4 蛋白	R&D Systems	314-BP-010
重组人 Wnt-3a 蛋白	R&D Systems	5036-WN
丙酮酸钠（100 mM）	ThermoFisher Scientific	11360070
大豆胰蛋白酶抑制剂，粉末状	Thermo Fisher Scientific	17075029
无菌去离子水	MilliQ		MilliQ 滤水系统
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Sigma	T4049-500ML
细胞培养设备
可调移液器（10、100、200、1000 µL）	Eppendorf	Various
适用于胚胎干细胞的基底膜基质（Matrigel）	Corning	CLS354277-1EA
离心机	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2，37 °C
培养箱	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
干细胞切割工具（0.190–0.210 mm）	Vitrolife	14601
无菌离心管	Sarstedt	Various
无菌一次性玻璃巴斯德移液管（150 mm）	VWR	612-1701
无菌移液器吸头（0.1–1000 µL）	Biotix VWR	Various
无菌血清移液管（5、10、25、50 mL）	Costar	Various
T25 培养瓶（Nunc）	ThermoFisher Scientific	156367