小鼠模型中用于稳定遗传修饰的病毒立体定位注射

摘要

来源：Porlan, E., 等．用于分析成年小鼠V-SVZ神经干细胞自主性与非自主性效应的稳定高效遗传修饰细胞方法．J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了通过立体定位注射携带治疗基因的病毒，在小鼠模型中对脑室-脑下室区（V-SVZ）的神经干细胞（NSCs）进行稳定遗传修饰的方法。该病毒进入神经干细胞后，发生逆转录并整合到基因组中，从而实现稳定且高效的遗传修饰，可用于神经治疗应用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 向侧脑室（LV）向室管膜下区（V-SVZ）/纹状体边界或直接向侧脑室（LV）进行立体定位注射

1. LV 显微注射
   1. 选择并灭菌手术所需器械（手术刀、钻头和小镊子）。
   2. 通过腹腔注射（ip）给予兽医监督下的氯胺酮和美托咪啶混合物，对一只6-8周龄的小鼠进行麻醉。称量每只动物的体重，并按每只50-75 mg氯胺酮和0.5-1 mg美托咪啶的剂量给药 每 每公斤小鼠体重（每只小鼠约100–125 µl的氯胺酮/美托咪定工作溶液）
   3. 通过捏压动物的脚趾、尾巴或耳朵来评估麻醉深度，确保动物无任何反应。
   4. 小鼠麻醉后，皮下注射丁丙诺啡，终剂量为每公斤小鼠体重0.4–0.5 mg，以减轻术后疼痛。
   5. 剃除耳间区域的毛发，并使用碘伏类消毒剂（如聚维酮碘）或70%乙醇对皮肤进行消毒。使用无菌棉签擦拭清洁。注意避免过度湿润动物体表，以免加重低体温。
   6. 将动物置于立体定位仪上，呈俯卧位，并使用仪器的耳杆和腭部支撑固定头部。将小鼠置于设定为37 °C的加热垫上保温，并在眼睛表面涂抹眼用润滑剂。
   7. 使用手术刀在头部皮肤上纵向做一个1厘米长的切口，用精细镊子轻轻牵拉皮肤以暴露颅骨。
   8. 使用无菌棉签仔细清洁骨面，清除暴露的颅骨上残留的任何组织。
   9. 使用注射器固定器将灭菌后的注射器安装到立体定位仪上。
   10. 沿 x、y 和 z 轴移动注射器支架，直至注射器针尖位于前囟点，即矢状缝（纵向和正中缝）与冠状缝垂直相交的交点图1b确保背腹轴（DV轴）的“零”位置位于前囟点处的颅骨表面。
   11. 将注射器移至 x 和 y 目标坐标（参见 表1 和 图1b).
   12. 在游标卡尺上标注 x、y 和 z 方向的目标坐标，以便后续能够重新定位至注射位点。使用外科标记笔在骨面上标记 x 和 y 坐标位置。
   13. 将注射器移离工作区域。
   14. 使用电钻在颅骨上小心钻孔，注意不要损伤脑组织。切勿钻破软脑膜表面，以免损伤脑表面。
   15. 用注射器吸取 1 µl 的 10⁶ 每微升转导单位（TU/µl）病毒溶液。使用尖端角度为10–12°的33号锐利斜面针头。将注射器针头垂直于脑表面，即与之成90°角放置。
   16. 将注射器移回注射部位，并向下移动，直至针尖接触软脑膜表面。
   17. 将注射器沿DV轴刺入脑内，到达z坐标位置。
   18. 以0.2 µl/min的速率缓慢释放病毒悬液，以最大限度减少因液体压力过大而对脑组织造成的损伤。
   19. 等待5-10分钟以尽量减少病毒悬液的回流，然后非常缓慢地撤出注射器。

注射区域	坐标
	前-后 (AP)	内侧-外侧 (ML)	背-腹 (DV)
SEZ/纹状体边界	+0.6 mm	+1.2 mm	-3.0 mm
侧脑室	-0.3 mm	+1.0 mm	-2.6 mm

表1：注射用立体定位坐标。 前后（AP）和内侧-外侧（ML）轴的 x 和 y 坐标以相对于前囟的距离（单位：mm）表示。“-”表示“向后方”。对于背腹（DV）坐标，“0”为前囟点处颅骨表面，DV 坐标表示从此点向下的距离（单位：mm）。

结果

图1：实验各步骤的示意图。 （a）用于体内标记研究的慢病毒（LVs）的制备，从使用适当质粒转染人胚胎肾293T（HEK293T）细胞以产生慢病毒，到通过流式细胞术使用所示公式测定病毒滴度。图中注明了质粒名称和离心机转子名称。（b 和 c）立体定位注射慢病毒。“b”展示了一个游标卡尺的示例，该装置是立体定位仪的一部分，用于精确测量。例如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器：
Vernier 立体定位仪	NeuroLab, Leica	39463001
注射器固定器	KD Scientific	KDS-311-CE
33 号注射器	Hamilton	P/N 84851/00	85RN
电动钻	Fine Science Tool	98096
加热毯	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C-AL01
剃毛器	Jata	MP373N	型号：beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03
试剂：
美托咪定	Esteve	Domtor	商品化溶液，浓度为 1 mg/ml
氯胺酮	Merial	Imalgene 500	商品化溶液，浓度为 50 mg/ml
美托咪定/氯胺酮混合液			配制工作混合液，使美托咪定终浓度为 0.2 mg/ml，氯胺酮终浓度为 15 mg/ml，溶于生理盐水中。作为麻醉剂使用，注射体积应使美托咪定终剂量为 0.5–1 mg/kg 体重，氯胺酮终剂量为 50–75 mg/kg 体重
布托啡诺	Pfizer	Torbugesic	储存液浓度为 10 mg/ml。作为镇痛剂使用，稀释至 1 mg/ml 生理盐水中
0.9% 生理盐水	Braun	13465412
外科标记笔	Staedler	313-9	永久性 Lumocolor 笔
眼用润滑剂		Siccafluid	0.5 g/剂，含 carbomer 974P
聚维酮碘	Betadine	694109.6	10% 聚维酮碘