来源：Mangold, K., H el. al., 胚胎发育第7.5天小鼠神经板靶向子宫内纳米注射（NEPTUNE）技术。J. Vis. Exp. (2022)
本视频展示了在小鼠胚胎模型中针对神经板进行宫内纳米注射的方法。将高滴度的慢病毒溶液注射到羊膜腔中，使其整合到神经板细胞内，从而实现神经发育研究和治疗应用中的稳定基因操作。
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方法文章
通过子宫内纳米注射在小鼠胚胎模型中操控神经板细胞
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2025年8月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 注射
注意：本实验中使用的所有器械均需在手术前以及每只小鼠之间进行灭菌处理。
- 对具有理想大小腔隙的第一只雌性动物进行麻醉。
- 将雌性动物放置于手术台上并固定。
- 在眼睛上涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥，并皮下注射镇痛药物。
注意：推荐镇痛药：布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg 体重）或氟尼辛（2.5 mg/kg）或类似药物，具体应符合当地动物福利法规。围手术期多模式镇痛通过注射镇痛药和异氟烷维持。 - 使用浸有 0.5 mg/mL 氯己定溶液（或类似物）的布巾无菌擦拭下腹部，并擦干皮肤。使用手术剪在下腹部做一条 1.5–2.0 cm 的垂直正中皮肤切口。
注意：应按照当地批准的消毒程序准备手术区域。 - 轻柔提起皮肤，并将切口周围约 1 cm 范围内的皮肤与下方肌肉层分离，以便术后缝合。
- 在肌肉层做一条 1 cm 的垂直正中切口。
- 用一对镊子提起一侧的皮肤和肌肉层，用另一对镊子寻找子宫角。
注意：蜕膜排列如同项链上的珠子，而肠道则为一条长而连续的管道（图 1A）。 - 用镊子小心地将两侧子宫角从腹腔中拉出。应夹持胚胎之间的组织，切勿直接挤压胚胎（图 1B）。
注意：子宫在宫颈处与身体相连，两个卵巢/输卵管通过韧带附着。切勿将子宫从这些固定点拉离或分离。 - 计数并记录左侧和右侧的胚胎数量。
- 从卵巢向宫颈或从宫颈向卵巢方向对胚胎进行编号。
注意：若需在胚胎发育阶段回收已注射胚胎，此步骤尤为重要。 - 用湿润的棉签轻轻将除前三个待注射胚胎外的所有胚胎推回腹腔。
- 在培养皿的弹性膜上滴加一滴 PBS（磷酸盐缓冲液），并立即将其置于胚胎上方。
- 将闭合的镊子插入弹性膜切口，松开镊子以撑开弹性膜切口，使液体滴落至胚胎上。
注意：此举可确保胚胎再水化，并使弹性膜紧贴雌性动物湿润的皮肤，防止后续步骤中 PBS 泄漏。 - 用镊子将对应三个胚胎长度的一段子宫通过弹性膜拉出，并将培养皿轻轻放置于雌性动物腹部上方。
- 使用镊子和湿润棉签调整子宫位置及弹性膜，确保弹性膜与雌性动物皮肤密封，防止 PBS 泄漏。
- 使用四个黏土支脚将培养皿固定于腹部正上方，以减少对雌性动物的压力，并降低成像过程对呼吸和心跳的敏感性。
- 将黏土圆柱体压在胚胎/子宫右侧以固定子宫（图 1C）。
注意：此方向说明假设注射针位于雌性动物左侧，且暴露的是其左侧子宫角的胚胎。子宫侧别（左或右子宫角）至关重要，因为羊膜腔（AC）可能朝向注射针（左侧子宫角；图 1D）或朝向固定用黏土圆柱体（右侧子宫角；图 1E）。 - 若需注射右侧子宫角的胚胎，应将黏土圆柱体置于胚胎左侧（图 1F），并将加热台旋转 180°（图 1G）以获得正确方向。若可移动注射针，则应根据具体实验装置进行相应调整。
- 向培养皿中加入 PBS，直至胚胎和子宫完全浸没于 PBS 中。
- 将超声探头缓慢浸入 PBS，并调整小鼠/手术台位置，使第一个胚胎与超声探头对齐，以便记录注射过程。
注意：“第一个”指从卵巢向宫颈方向编号的第一个胚胎。 - 扫描全部三个胚胎并检查其羊膜腔（AC）。按以下方法确定注射体积：
- 使用超声设备测量 AC 直径。若 AC 直径 ≤0.2 mm，则注射 69 nL；若 AC 直径 >0.2 mm 且 ≤0.29 mm，则注射 2 × 69 nL（= 138 nL）；若 AC 直径 > 0.29 mm，则注射 3 × 69 nL（= 207 nL）（图 1H）。
注意：既往实验表明，在 E7.5 阶段，注射体积最高达 207 nL 均可良好耐受。当 AC 相对体积增加不超过 90% 时，可实现成功注射且对存活率影响最小。同窝仔鼠或不同小鼠品系间 AC 大小存在差异，可能需要进一步优化。
- 使用超声设备测量 AC 直径。若 AC 直径 ≤0.2 mm，则注射 69 nL；若 AC 直径 >0.2 mm 且 ≤0.29 mm，则注射 2 × 69 nL（= 138 nL）；若 AC 直径 > 0.29 mm，则注射 3 × 69 nL（= 207 nL）（图 1H）。
- 使用注射控制器设定注射体积。
- 将注射速度设为慢速，注射速率为 23 nL/s。
注意：不同型号设备可能导致注射力不同。 - 使用轨道系统上的主轮（x 轴和 z 轴平面，图 1I）将注射针浸入 PBS，并在纳米注射控制器上按排空，直至液体到达针尖。
注意：若针头堵塞，按排空可溶解或排出堵塞物。 - 将针头从 PBS 中提起并按注射，确认释放出约所需体积的液滴。
- 将针头重新浸入 PBS，并通过显微操作仪的 y 轴轮移动纳米注射装置，使针头与超声探头及胚胎对齐（图 1J）。
注意：当针尖在超声图像上呈现为亮点时，即为完全对齐（图 1K,L）。显微操作仪可在三个方向平面上移动针头。 - 使用注射角度调节轮调整针头角度，确保注射方向相对于子宫壁接近垂直。使用显微操作仪上的注射轮一次性将针头插入羊膜腔（图 1J-M）。密切观察针尖亮度。若针尖在超声图像中消失，可前后移动超声探头以重新对焦。
注意：针头进入羊膜腔后，可在不损伤胚胎的前提下进行微小位置和焦点调整（调整范围约 ~0.3 mm）。切勿超出此范围调整针头位置。 - 按注射（对于 207 nL，设定体积为 69 nL，并注射三次）。注射完成后，再等待 5–10 秒，然后轻柔地一次性撤回针头。
- 移动载物台至下一个胚胎，若其 AC 大小合适，则重复步骤 1.22–1.26 对其余两个胚胎进行注射。
- 使用显微操作仪将超声探头和针头从 PBS 中提起。将针头转向操作者反方向，以防损坏或造成伤害。
- 用镊子将第 1 和第 2 个胚胎轻轻推回雌性动物腹腔。轻轻夹住第 3 个胚胎附近的组织，将子宫向弹性膜切口上端拉出。用镊子轻轻提起第 4–6 个胚胎，使第 3 个胚胎重新进入腹腔。
注意：此步骤可在不更换 PBS 或移除培养皿的情况下完成。 - 根据需要重复操作，直至所有具有理想 AC 大小的胚胎均完成注射，或达到时间限制。
- 轻柔地将胚胎/子宫推回雌性动物腹腔。
- 吸除 PBS 并移除培养皿。若使用了病毒，应将其作为感染性废物处理。
- 使用薇乔线（Vicryl，USP 6-0，针长 13 mm，3/8 圆弧）以连续或间断缝合法缝合肌肉层，并用 1–2 个夹子闭合皮肤（参见材料表）。
- 关闭异氟烷泵。
- 移除手术胶带，将雌性动物以俯卧位（腹部朝下）置于清洁笼盒中，并放置于 40 °C 加热板上。
注意：预计雌性动物将在 10 分钟内恢复意识并能够活动。确保整个操作在 30 分钟内完成。雌性动物的遗传背景、年龄和体重可能影响其对麻醉的敏感性。术中应监测小鼠是否出现呼吸缓慢（呼吸过慢表示麻醉过深）或活动（表示麻醉过浅）。根据当地动物福利法规，必要时可在首次注射 8 小时后给予布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg 体重）或氟尼辛（2.5 mg/kg）或类似药物。 - 若需对另一只雌性动物进行注射，在监测第一只动物苏醒的同时准备手术区域。
- 用 70% 乙醇擦拭手术器械以去除残留血液或组织，并在预热的玻璃珠灭菌器中灭菌 10 秒。丢弃棉签，使用纸巾。用纸巾将培养皿和黏土部件擦干。
- 重复步骤 1.1–1.35，直至所有雌性动物均完成注射。
- 排空并丢弃针头。
- 若针头中残留病毒或注射液，按纳米注射控制器上的排空键，将内容物排至纸巾上。
- 按填充键完全回撤金属推杆，直至控制器发出两次蜂鸣声，表示推杆已完全回撤。
- 松开卡箍，将针头从金属推杆上滑下，丢弃至锐器废物容器中。
- 清洁 BSL-2（生物安全二级）操作台。
- 若使用了病毒，应向整个手术区域喷洒消毒剂（参见材料表）。15 分钟后，擦去消毒剂，并用 70% 乙醇清洁整个手术区域。若未使用病毒，则用 70% 乙醇清洁所有表面。
- 用干燥、柔软、无绒纸巾擦去超声探头上残留的 PBS。
- 根据生物安全指南丢弃废弃物。
- 关闭超声设备、加热台、BSL-2 操作台及 O2 供气系统。
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结果
图1：成功注射时羊膜腔的最佳大小和方向。（A）多个E7.5天的蜕膜组成的子宫角，形状类似一串球体（下方），与大肠（上方）对比。（B）用镊子夹住蜕膜之间的子宫组织（白色虚线所示）。避免直接用镊子挤压蜕膜（白色箭头所示），因为在此早期阶段，蜕膜和发育中的胚胎...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD生物科学 | 309628 | |
| 27 G 针头 | BD 生物科学 | 300635 | |
| 3.5 英寸毛细管 | Drummond Scientific | 3000203G/X | 用于吸取自制针头 |
| 70 MHz MS 系列换能器 | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic 清澈超声耦合剂 | Parker Laboratories | 3月-50 | |
| Autoclip 施夹器 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1小鼠 | 查尔斯河实验室，德国 | Crl:CD1(ICR) | 雌性：8周龄起；雄性：12周龄起 |
| 棉签 | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| 精细直型敷料镊 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EZ夹子 9 mm | Angthos | 59027 | 视频片段 |
| 虹膜剪，超锐型，直头，9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| 异氟烷 | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | 购自瑞典药房 |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| 膜片剥离技术 | Visual Sonics | SA-11053 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 油泥 | Sense AB | 10209 | |
| 小鼠操作台 | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II 自动注射器套件 | 德拉蒙德 | 3-000-205A | |
| Parafilm | 贝米斯 | HS234526C | |
| 带中央开口的培养皿（低壁） | Visual Sonics | SA-11620 | |
| 培养皿，（ØxH）：92 × 16 毫米 | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | 杜邦 | 130000132037 | 消毒剂 |
| 硅胶膜 | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250 热珠灭菌器 | Angthos | 31100 | |
| 外科胶带（1.25 cm × 9.14 m） | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual（医用空气） & O2) 麻醉系统 | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo 成像系统 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0；C-3 针，45 cm 紫色单丝 | Agnthos | J384H |
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