通过电穿孔法将基因转入啮齿类动物坐骨神经的施万细胞

摘要

来源：Ino, D. et. al., 通过电穿孔法将基因体内转移至啮齿类动物坐骨神经的施万细胞。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了利用电穿孔技术将基因在活体中转染至啮齿类动物坐骨神经的施万细胞。将质粒DNA与染料的混合溶液注射入神经，通过施加电脉冲促进DNA进入细胞。随后DNA整合至细胞基因组，实现施万细胞中成功的基因转染。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 质粒DNA的制备

1. 通过将互补DNA（cDNA）或短发夹RNA（shRNA）序列亚克隆到适用于哺乳动物细胞的表达质粒中，构建用于体内电穿孔的DNA质粒。使用由巨细胞病毒即时早期增强子与鸡β-肌动蛋白启动子融合（CAG）驱动的质粒，因其可实现强而稳定的表达。若需在CAG启动子控制下表达shRNA，应采用基于mir30的shRNA表达盒系统进行shRNA的亚克隆。
2. 按照制造商说明书，使用大提试剂盒纯化质粒DNA，并用HEPES缓冲盐溶液（140 mM氯化钠，NaCl；0.75 mM磷酸氢二钠，Na₂HPO₄；25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；pH 7.40）重悬DNA。将DNA浓度调整至≥4 µg/µl。
3. 将质粒DNA溶液配制至浓度为4 µg/µl，并加入少量快绿染料（终浓度0.01%），以标记注射位点。当需要同时进行多个质粒的电穿孔时，应将质粒DNA溶液的总浓度调整为4 µg/µl。
   注意：质粒DNA的最佳配比应根据各质粒的转染效率确定。

2. 手术器械和生理盐水的灭菌

1. 对手术器械和0.9% NaCl溶液进行高压灭菌。

3. 玻璃微电极的制备

1. 使用拉针仪拉制玻璃移液管。将移液管尖端切割至直径为30-50 µm。使用以下参数：加热温度600，拉速50，时间75。

4. 动物手术、DNA 注射与电穿孔

注意：该步骤的概述见图1。尽管此处描述的是大鼠幼鼠的操作方法，但使用相同流程也适用于更成熟的动物。

1. 在诱导箱中使用异氟烷麻醉大鼠，调节氧气流速至0.4 L/min，异氟烷浓度至4%（体积/体积），直至动物静止不动。通过夹趾反应测试确认麻醉效果。
2. 将大鼠置于预热的加热板上，在双目显微镜下通过面罩持续给予异氟烷以维持麻醉状态。调节氧气流速至0.2 L/min，异氟烷浓度至2%（vol/vol）。若动物眼睛睁开，使用眼药水防止角膜干燥。
3. 用手术胶带固定腿部。
4. 用聚维酮碘清洁大腿后侧皮肤，并用手术刀做切口
   注意： 如果手术区域有毛发覆盖，则需剃除。
5. 使用缝合针在股四头肌与股二头肌之间创建开口，暴露坐骨神经。
6. 用0.9% NaCl溶液润湿神经。用无绒纸吸去多余液体。
7. 将玻璃微电极的基部插入柔性管中，通过轻柔抽吸将适量的DNA溶液（至少一微升）吸入微电极内。
8. 用针轻轻牵拉神经远端，将暴露的神经抬起。
   注意： 不要对神经施加张力，以尽量减少机械应力。
9. 将玻璃微电极插入神经远端位点，并通过施加压力注入DNA溶液即 通过向柔性管的开口端吹气）注入DNA溶液，直至神经呈现绿色（最多1 µl）。由于频繁插入微量移液器可能损伤神经，移液器插入次数不得超过两次。
10. 将镊子型铂电极放置在距离神经约1-2 mm的位置。用电极与神经之间的0.9% NaCl溶液填充间隙。
    注意： 不要用电极夹持神经，以避免对神经造成机械性损伤。
11. 使用电穿孔仪配合电极向注射部位施加电脉冲。完成第一组脉冲后，翻转电极并施加第二组脉冲。参数设置如下：电压，50 V；脉冲持续时间，5 msec；脉冲间隔，100 msec；脉冲次数，4次。
12. 用0.9% NaCl溶液清洁电穿孔部位。

5. 电穿孔后处理

1. 用氰基丙烯酸酯胶水闭合切口。
2. 待胶水干燥后，用聚维碘酮碘清洁伤口。
3. 将幼崽从面罩中取出，放置于加热垫上至少一小时，使其从麻醉状态中完全恢复。

结果

图1：体内电穿孔方法示意图。首先，暴露麻醉大鼠的坐骨神经。其次，将质粒DNA注射至坐骨神经中。第三，通过镊子形状的电极向注射部位施加电脉冲。最后，用胶水闭合伤口。该操作可在对侧神经上重复进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Genopure 质粒大提试剂盒	Roche	03 143 422 001	质粒DNA纯化试剂盒
快绿CFC	WAKO	069-00032	DNA注射用染料
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	玻璃毛细管
吸液管路	Drummond	05-2000-00	显微注射用吸液管
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	微电极拉制仪
CUY21 Single cell	BEX	电穿孔仪 CUY21 Single Cell	脉冲发生器
电子加热器	KODEN	CAH-6A	手术过程中保温用加热器
异氟烷	Mylan	1119701G1076	麻醉剂