利用多孔硅薄膜在大鼠嗜铬细胞瘤12细胞中持续递送神经生长因子

摘要

来源：Rosenberg, M., 等. 设计多孔硅薄膜作为神经生长因子的载体. J. Vis. Exp. (2019).

本视频展示了使用可降解的纳米结构多孔硅（PSi）薄膜持续释放神经生长因子（NGF），以支持PC12细胞分化的应用。NGF通过静电相互作用吸附在薄膜的孔隙中，并通过扩散和支架降解逐步释放到培养基中。这种可控释放可促进PC12细胞的存活，并在较长时间内促进神经突的生长与分支。

方案

1. 氧化多孔硅（PSiO₂）载体的制备

1. 切割一片单面抛光的硅（Si）晶圆 <100> 使用金刚石笔将正面重掺硼的p型硅片（电阻率为0.95 mΩ·cm）切割成1.5 cm × 1.5 cm的样品。
2. 在管式炉中，于环境空气下以400 °C氧化Si样品2 h（升温速率：25 °C/min，自然冷却）。
3. 将硅样品浸入由48%水合氢氟酸（HF）和双蒸水（ddH₂O）组成的溶液中₂O）、甲醇（99.9%）和乙醇（99.9%）按体积比1:1:3混合的溶液中浸泡5分钟；随后用乙醇冲洗样品三次，并在氮气流下干燥。
   注意：仅可使用塑料器皿配制和储存氢氟酸溶液，因为氢氟酸会溶解玻璃。
   警告：HF 是一种高度腐蚀性的液体，必须极其小心地操作。若发生接触，应立即用大量清水彻底冲洗，并在受影响区域涂抹 HF 解毒凝胶；随后立即就医。
4. 将硅样品安装在聚四氟乙烯刻蚀池中，使用铝箔条作为背接触，铂丝线圈作为对电极。
5. 在250 mA/cm²的恒定电流密度下，将牺牲层置于体积比为3:1的氢氟酸水溶液与乙醇（99.9%）的混合液中刻蚀30秒²；然后用乙醇冲洗所得PSi薄膜表面三次，并在氮气流下干燥。
6. 将新鲜蚀刻的多孔层在0.1 M的氢氧化钠（NaOH）水溶液中溶解2分钟。随后用乙醇冲洗三次，并在氮气流下干燥。
7. 将样品浸入48%的氢氟酸（HF）水溶液中，ddH₂O₂O₂ 和乙醇（99.9%）（1:1:3 v/v）混合溶液中处理 2 分钟，随后用乙醇冲洗三次，并在氮气流下干燥。
8. 在体积比为3:1的氢氟酸水溶液与乙醇（99.9%）混合液中，以250 mA/cm²的恒定电流密度对硅样品进行电化学腐蚀，持续20秒²；然后用乙醇冲洗所得PSi薄膜表面三次，并在氮气流下干燥。
9. 将新鲜蚀刻的多孔硅（PSi）样品在管式炉中于环境空气下800 °C进行热氧化处理1小时（升温速率：25 °C/min，自然冷却），以形成多孔SiO₂₂ (PSiO₂支架
10. 旋涂 PSiO₂ 以4,000 rpm转速旋涂正性厚光刻胶1分钟；随后将涂覆样品在90 °C下烘烤2分钟（升温速率：5 °C/min，自然冷却）。
11. 将PSiO切碎₂ 使用切割锯将样品切成8 mm × 8 mm的样品。
12. 用丙酮浸泡切割后的样品3小时以去除光刻胶，随后用乙醇彻底冲洗，并在氮气流下干燥。

2. 用神经生长因子（NGF）负载PSiO₂

1. 配制NGF负载溶液：将20 µg小鼠β-NGF溶解于400 µL体积比为1:1（v/v）的0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）与ddH₂O混合溶液中。
2. 在PSiO₂样品表面加入52 µL上述负载溶液，置于加盖容器中室温（RT）孵育2小时。
   注意：孵育过程中需保持容器内高湿度，防止溶液干燥。
3. 孵育结束后，收集样品表面的溶液，用于后续测定PSiO₂载体中NGF的负载量。
   注意：NGF向PSiO₂中的负载应在使用前立即进行；由于蛋白质干燥和变性的风险，本步骤不可暂停。

3. 含NGF的PSiO₂载体存在下的细胞活力与生长

1. 大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞培养
   1. 通过向 Roselle Park 医学研究所（RPMI）培养基中添加 10% 马血清（HS）、5% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 0.2% 两性霉素制备基础生长培养基。
   2. 通过向 RPMI 培养基中添加 1% HS、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 0.2% 两性霉素制备分化培养基。
   3. 将细胞悬液（10⁶ 个细胞）接种于含 10 mL 基础生长培养基的 75 cm² 培养瓶中，培养 8 天；每隔 2 天向培养瓶中添加 10 mL 基础生长培养基。
   4. 为获得分化的 PC12 细胞培养物，将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 200 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
   5. 用 5 mL 新鲜基础生长培养基重悬细胞，并在室温下以 200 × g 再次离心 5 分钟；弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 基础生长培养基中。
   6. 为分离细胞团簇，使用 23 G 注射器反复吹打细胞 10 次。
   7. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将 10⁴ 个细胞/cm² 的工作面积接种至涂有 I 型胶原的培养板中，加入分化培养基。
   8. 24 小时后，每孔加入新鲜的小鼠 β-NGF（50 ng/mL）或载有 NGF 的 PSiO₂ 载体。
      注意：更高浓度的 NGF（>50 ng/mL）具有与指定浓度相同的效果。
   9. 每隔 2 天更换一次分化培养基。
   10. 为评估细胞活力，在代表性时间点加入 10%（v/v）基于刃天青的活力指示溶液，于 37 °C 孵育 5 小时；使用分光光度计在 490 nm 处测定吸光度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Gadot	830101375
两性霉素	Biological Industries	03-028-1B
氢氟酸水溶液 (48%)	Merck	101513
AZ4533 光刻胶	Metal Chem, Inc.	AZ4533
BSA 第五组分	MP biomedicals	216006950
BSA 溶液 (10%)	Biological Industries	03-010-1B
I 型胶原蛋白	Corning Inc.	354236
胶原酶	Enco	LS004176
胶原蛋白包被的塑料盖玻片	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
无水乙醇 (99.9%)	Merck	818760
胎牛血清	Biological Industries	04-121-1A
盐酸胍	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Ham's F-12 营养混合物	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1 M)	Thermo Scientific	15630-056
马血清	Biological Industries	04-124-1A
L-15 培养基	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
层粘连蛋白	Thermo Scientific	23017015
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1A
小鼠 β-神经生长因子	Peprotech	450-34-20
正常驴血清 (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
木瓜蛋白酶	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7.4)			将 10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl 和 2.7 mM KCl 溶解于双蒸水 (ddH₂O, 18 MΩ·cm) 中配制而成。
PBS ×10	Biological Industries	02-020-1A
PC12 细胞系	ATCC	CRL-1721
青霉素-链霉素	Biological Industries	03-032-1B
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
PrestoBlue 试剂	Thermo Scientific	A13261
RPMI 培养基	Biological Industries	01-100-1A
硅晶圆	Siltronix Corp.		高度硼掺杂，p 型，电阻率为 0.00095 Ω·cm，<100> 晶向
叠氮化钠	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
氢氧化钠 (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
单宁酸	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
吐温 X-100	Chem-Impex International Inc.	1279