通过单细胞电穿孔在小鼠海马脑片培养中实现基因表达

摘要

来源：Keener, D. G., et al. 在不同类器官型脑片培养中对小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元进行单细胞电穿孔。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了单细胞电穿孔技术，用于将质粒DNA导入小鼠海马脑片培养物中的神经元。该操作包括精确的移液管定位、压力调节以及施加电穿孔脉冲，以瞬时增加神经元细胞膜的通透性，从而实现基因转移。电穿孔完成后，将脑片进行孵育，以促进所导入目的基因的表达。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 切片培养物制备

1. 按照先前所述方法，使用出生后6至7天、任一性别的小鼠制备小鼠海马器官型脑片培养物。
   1. 制备用于器官型脑片培养的解剖液，成分为（单位：mM）：238 蔗糖、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，然后用5% CO₂/95% O₂混合气体饱和，调节pH至7.4。
   2. 制备器官型脑片培养液，成分为：78.8%（v/v）Eagle最低必需培养基、20%（v/v）马血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mM葡萄糖、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）、胰岛素（1 µg/mL）和0.06 mM抗坏血酸，调节pH至7.3。使用渗透压计将渗透压调节至310–330 osmol。
   3. 使用两把解剖铲从完整脑组织中分离出海马，用组织切片机切成400 µm厚的脑片。用两把镊子将脑片分开，并转移至6孔板中的30 mm细胞培养插入式培养小室，培养小室下方加入950 µL培养液。
2. 将器官型脑片培养物置于组织培养孵箱（35°C，5% CO₂）中培养，每两天更换一次脑片培养液。

2. 质粒制备

1. 准备目的基因的质粒。
   1. 将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因亚克隆至pCAG载体中。
   2. 使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化pCAG-EGFP质粒，并溶于内液中，内液成分为含二乙基焦碳酸酯处理水的溶液，其中包含140 mM K-甲磺酸盐、0.2 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）、2 mM MgCl₂和10 mM HEPES，用KOH调节pH至7.3（质粒浓度：0.1 µg/µL）。

3. 玻璃移液管的制备

1. 在拉针仪上拉制硼硅酸盐玻璃移液管（4.5 – 8 MΩ）（图1A）。
   注意：用于全细胞膜片钳记录的玻璃移液管适用于电穿孔。
2. 将玻璃移液管在200°C下烘烤过夜以灭菌。
3. 在解剖显微镜下检查移液管尖端的大小，以估算其电学电阻。
   1. 可选：将移液管连接至电穿孔电极，并使用显微操作器将移液管尖端置入经滤膜灭菌的人工脑脊液（aCSF）中，以验证移液管电阻。人工脑脊液成分（单位：mM）为：119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、5 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，并通入5% CO₂ / 95% O₂混合气体，调节pH至7.4。通过电穿孔仪读数确认实际电阻。
      注意：移液管尖端越尖锐，其电学电阻越大。移液管电阻应低于10 MΩ。高电阻的玻璃移液管（图1B）在重复电穿孔过程中常出现尖端堵塞。

4. 电穿孔装置设置

1. 将电穿孔仪安装在标准的全细胞电生理装置中，该装置配备有安装在移动台上的直立显微镜、微操纵器和蠕动泵。
2. 将电穿孔仪的头部装置安装到微操纵器上，并将一对扬声器连接至电穿孔仪。将电穿孔仪连接至脚踏开关，以便在准备就绪时发送脉冲。
   注意： 扬声器开启时会发出音调，该音调可指示电极处的电学电阻，从而能够在不转移操作注意力的情况下判断电阻的相对变化。

5. 电穿孔准备

1. 将脑片培养插件从6孔板转移至含有900 µL培养基的3 cm培养皿中，并置于台式CO₂培养箱内孵育，直至准备进行电穿孔操作。
   1. 在电穿孔后用于培养脑片的3.5 cm培养皿中，预先用新鲜的脑片培养基（1 mL）孵育新制备的培养插件，至少30分钟。
2. 清洁并准备电穿孔装置。
   1. 实验当天开始前，用10%次氯酸钠溶液灌流管路5分钟，以对管路和腔室进行灭菌。
   2. 用去离子灭菌水灌流管路至少30分钟，彻底冲洗。
   3. 用滤膜除菌的含0.001 mM河豚毒素（TTX）的人工脑脊液（aCSF）灌流管路。
      注意：TTX可最小化因中间神经元过度兴奋导致的细胞毒性与细胞死亡。
3. 设置电穿孔仪的脉冲参数：电压幅度5 V，方波脉冲，脉冲串持续时间500 ms，频率50 Hz，脉冲宽度500 µs。
4. 用5 µL含质粒的内液填充玻璃移液管。
   1. 通过轻弹并多次轻轻敲击移液管尖端，去除其中截留的气泡。
   2. 在解剖显微镜下观察尖端是否受损，或重复步骤3.3.1检测移液管电阻以确认其状态。
      注意：若尖端受损，必须丢弃该玻璃移液管，并使用步骤3中先前制备的新移液管重复本步骤。
5. 将移液管牢固连接至电极，并打开扬声器。当移液管尖端接触aCSF培养基时，记录电穿孔仪的读数（即移液管电阻）。
6. 使用锋利刀片切割培养插件膜，分离出一片脑片培养物。使用锐角镊子小心地将脑片转移至电穿孔腔室，并用脑片固定锚固定其位置。
   1. 每次将脑片培养物置于培养箱外的时间不得超过30分钟，以避免神经元健康或功能改变等副作用。

6. 对目标细胞进行电穿孔

1. 使用口部或连接在管路末端的1 mL注射器向移液管施加正压（0.2–0.5 mL压力）。
2. 利用显微操作器的三维旋钮控制，将移液管尖端移动至组织切片培养物表面附近。
3. 选择一个目标细胞并靠近它，在持续施加正压的同时，直至在显微镜下可观察到细胞表面形成凹陷。
4. 执行压力循环。
   1. 通过口部快速施加轻微负压，使移液管尖端与细胞质膜之间形成松散封接，表现为膜部分进入移液管尖端。通过监听扬声器发出的声音音调升高，观察到移液管电阻增加（约为初始电阻的2.5倍）。随后迅速重新施加正压，使凹陷再次形成。
   2. 立即连续完成至少两次额外的压力循环，不作停顿，然后持续施加负压1秒。
      注意：在循环之间停顿、施加过大的压力或持续负压时间过长，可能导致细胞严重损伤，甚至在电穿孔过程中死亡。
5. 当扬声器声音音调达到稳定峰值（表明电阻达到峰值）时，立即用脚踏开关触发电穿孔仪一次脉冲。在达到峰值电阻后，不得超过1秒才发出脉冲。
   注意：采用本方案时，我们未观察到脱靶电穿孔现象。仅在压力循环期间与玻璃移液管接触的细胞被转染。将移液管置于其他神经元附近不会导致基因转染。
6. 在不施加压力的情况下，将移液管从细胞缓慢回撤约100 µm。
7. 重新施加正压，确认电阻值与步骤5.5中记录的读数相近，然后接近下一个细胞。
   1. 通过施加正压清除可能的堵塞，堵塞可通过视觉观察或电穿孔后移液管电阻显著升高（>15%）来识别。
      注意：如果无可见堵塞但电阻仍显著升高，则应丢弃该移液管并更换新的。通常情况下，若操作谨慎，一根移液管最多可用于20次电穿孔操作。
8. 电穿孔完成后，将切片培养物转移至新的培养插入物中，并在35°C培养箱中孵育最多3天。

结果

图1：两个具有代表性的玻璃移液管图像。（A）显示本方案中使用的较低电阻（6.5 MΩ）移液管，以及（B）典型用于电穿孔方案的较高电阻（10.4 MΩ）移液管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒制备
质粒纯化试剂盒	Qiagen	12362
器官型脑片培养制备
6孔板	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 镊子	FST	#5/45	用于器官型脑片培养制备的弯头解剖镊
滤器瓶装置	Millipore	SCHVU02RE	培养基的过滤与储存
培养箱	Binder	BD C150-UL
McIlwain 组织切片机	TED PELLA, INC.	10180	用于器官型脑片培养制备的组织切片设备
Millicell 细胞培养插入式培养皿，30 mm	Millipore	PIHP03050	器官型脑片培养用插入式培养皿
渗透压计	Precision Systems	OSMETTE II
聚四氟乙烯涂层刮勺	Cole-Parmer	SK-06369-11
剪刀	FST	14958-09
体视显微镜	Olympus	SZ61
无菌真空过滤系统	Millipore	SCGPT01RE	aCSF的过滤与储存
电极制备
毛细玻璃管	Warner Instruments	640796
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	拉制仪
烘箱	Binder	BD (E2)
拉制仪用加热丝	Sutter Instrument	FB330B	拉制仪
单细胞电穿孔
3.5 mm Falcon 培养皿	BD Falcon	353001
气浮台	TMC	63-7512E
电穿孔系统	Molecular Devices	Axoporator 800A	电穿孔仪