在大鼠模型中注射自组装肽和神经前体细胞进行脊髓修复

摘要

资料来源：Zweckberger， K. 等人。神经前体细胞和自组装肽在实验性颈脊髓损伤中的协同使用。 J. Vis. Exp. （2015）。

该协议展示了一种在大鼠模型中修复脊髓损伤的靶向注射方法。它涉及将自组装肽 （SAP） 输送到病变核心以形成支持性支架，然后在病变周围注射神经前体细胞 （NPC） 以重塑组织。

方案

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1.颈动脉瘤夹挫伤/加压模型

1. 手术前，将器械高压灭菌，并在整个手术过程中将其置于 70% 的酒精浴中以保持无菌。
2. 用氧气（O₂），一氧化二氮（N₂O）（1：1）和1.8-2.2%异氟醚的组合麻醉Wistar大鼠（250-270g），并通过气体麻醉面罩支持自主呼吸。对于麻醉诱导，从 5% 异氟醚开始 1 分钟，然后减少。在开始手术之前，通过给予疼痛刺激（例如，在爪子处）来控制麻醉深度。在眼睛上涂抹脂肪软膏，以避免干燥并防止后续感染。
将
3. 大鼠放在加热垫（37°C）上，并将头部固定在立体定向框架中。
剃
4. 掉颈椎周围的手术区域，并用聚维酮碘和 70% 酒精消毒。
5. 从颈椎 （C2） 在脊柱上方做一个中线切口，到达胸椎体 2 （T2） 的突出突起。
6. 直接在中线上沿颅尾方向切开椎体肌肉的外层（以避免出血），并进一步钝地解剖更深的肌肉层，直到到达棘突和椎板。插入牵开器。
定
7. 向椎体 T2 的突出棘突，以观察椎板切除术的目标水平。在对所选的椎板进行鉴定和显微外科准备后，切开黄斑韧带以松动椎板和棘突。最后，用骨剪在脊髓外侧切开椎板，轻轻去除，避免脊髓本身受到任何压迫。
   注意：最常见的水平是 C5/6、C6/7 或 C7/T1。围手术期死亡率越高，损伤程度越高。椎旁静脉窦出血很常见，可以通过用海绵仔细按压来解决。
8. 在插入夹子以对脐带造成创伤之前，请识别新出现的神经根以防止它们被夹住（尤其是在 C5/6 级）。
9. 为了保证夹子感应顺畅，用钩子从椎体背侧松开腹侧硬脑膜，并为夹子准备一条走廊。
10. 最后，插入打开的夹子并让它卡扣（快速闭合）以达到挫伤。夹子闭合力和夹子闭合持续时间决定了创伤的强度和压迫程度。常用的是夹紧力在15-35 g之间，夹紧持续时间为1分钟（图1）。
取
11. 下夹子后，将肌肉分成 2 层并闭合伤口。
12. 停止麻醉，让动物在您的持续观察下醒来，直到它恢复足够的意识以进行胸骨卧位。最后，将大鼠放在一个笼子里，并遵循术后治疗指南。
13. 由于动物与此类损伤的严重程度作斗争，因此您必须特别注意术后治疗：
    1. 根据临床症状给予止痛药（丁丙诺啡和美洛昔康分别为 3 天和 5 天）。
    皮
    2. 下注射额外的生理盐水溶液 3 天（每天 2 次，5-10 毫升 （ml））。
    3. 在手术前 2 天和术后 7 天之前在饮用水中提供抗生素（例如莫西沙星）
    4. 每天挤压膀胱 2-3 次，直到膀胱功能不断明显恢复。
    5. 每天至少观察一次手术动物的神经功能缺损和生理状况。

2.注射SAP和NPC（受伤后14天）

1. 如1.1至1.3所述诱导麻醉，将大鼠头部固定在立体定向框架中，取下缝线或伤口夹，用聚维酮碘和70%酒精对伤口和手术区域进行消毒。
2. 仔细解剖椎旁肌肉，插入牵开器，从硬脑膜显微镜下去除疤痕组织，然后重新暴露病变部位。
3. 制备浓度为 1% （w/v） 的 SAP，以进行细胞外基质凝胶。QL6 SAP 具有生理相容的 pH 值，无需在注射前缓冲。为了观察脊髓中的 SAP，请使用 QL6 的荧光衍生物（QL6-异硫氰酸荧光素 [FITC]）。
将
4. SAP（5微升（μl）注射到病变中心，分2份分布，每份2.5μl在中线的双侧。使用带有微玻璃毛细管（100微米（μm）外径[OD]）连接到立体定向框架的汉密尔顿注射器。用锋利的针尖小心地打开硬脑膜，并将玻璃毛细血管立体定向地插入受伤的脊髓 2 毫米 （mm）。
5. 注射 1/3 体积后，将针头移至 1.5 毫米深度，再注入 1/3 至 1 毫米。注射整个体积后，在取出注射器之前，等待 5 分钟以稳定凝胶形成。
6. 要产生 NPC，请使用成年椎间盘红色荧光蛋白 （DsRed） 小鼠（或黄色荧光蛋白 [YFP] 阳性小鼠，绿色）并将它们从室旁区分离和培养。
7. 通过台盼蓝染色评估 NPC 的活力，这表明细胞悬液中存在 ~90% 的活细胞。在生长培养基（50 x 10³ 个活细胞/μl）中稀释细胞，然后将它们用于细胞移植。
在
8. 损伤部位的2mm头侧和尾部进行四次2μl（8μl总体积，含有4 x 10⁵个NPC）脊髓内注射。打开硬脑膜后，将汉密尔顿微玻璃毛细管插入脊髓背表面下方1.5mm处，并注射2μl细胞悬液。选择约 0.5 μl/min （min） 的进样速率。
9. 在每次注射结束时和从脐带中取出毛细血管之前，等待至少1分钟，让组织拉伸以适应新的细胞体积。（图2）

结果

图1：夹挫伤/压迫动脉瘤模型。（一） 在C7 / T1椎板切除术和大鼠脊髓夹挫伤/压迫后通过手术显微镜拍照。 （B） 带有环形弹簧的夹子图片，保证精确的闭合力。

材料