在大鼠模型中注射自组装肽和神经前体细胞以修复脊髓损伤

摘要

来源：Zweckberger, K., et al. 神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用。 J. Vis. Exp. (2015)。

本方案展示了一种在大鼠模型中用于脊髓损伤修复的靶向注射方法。该方法包括将自组装多肽（SAPs）注入损伤核心区域以形成支持性支架，随后在损伤周围区域注射神经前体细胞（NPC），以实现组织重塑。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 颈部动脉瘤夹损伤/压迫模型

1. 手术前，将器械进行高压灭菌，并在整个手术过程中将其置于70%酒精浴中以保持无菌状态。
2. 使用氧气（O₂）、一氧化二氮（N₂O）（1:1）和1.8–2.2%异氟烷的混合气体对Wistar大鼠（250–270 g）进行麻醉，并通过气体麻醉面罩维持自主呼吸。诱导麻醉时，先使用5%异氟烷持续1分钟，随后降低浓度。手术开始前，通过施加疼痛刺激（例如在足部）来检测麻醉深度。在眼部涂抹油脂类软膏，以防止角膜干燥及继发感染。
3. 将大鼠置于加热垫（37 °C）上，并将其头部固定于立体定位仪中。
4. 剃除颈椎周围的手术区域毛发，并使用聚维酮碘和70%酒精进行消毒。
5. 从颈椎第2节（C2）开始，沿脊柱正中线做切口，延伸至胸椎第2节（T2）明显的棘突处。
6. 沿正中线方向纵向切开椎旁肌的表层（以避免出血），并钝性分离深层肌肉组织，直至暴露棘突和椎板。插入牵开器。
7. 以T2椎体明显的棘突为定位标志，确定椎板切除的目标节段。在显微外科技术下辨认并分离选定的椎板后，剪开黄韧带以松解椎板和棘突。最后，使用骨剪在脊髓侧方剪断椎板，并轻柔移除，避免对脊髓本身造成压迫。
   注意：最常见的损伤节段为C5/6、C6/7或C7/T1。损伤节段越靠近头侧，围手术期死亡率越高。椎旁静脉窦出血较为常见，可通过使用海绵小心压迫止血。
8. 在插入夹子造成脊髓损伤前，应先辨认并保护发出的神经根，避免夹伤（尤其在C5/6节段）。
9. 为确保夹子顺利插入，使用钩针从椎体背侧松解腹侧硬脊膜，为夹子建立通路。
10. 最后，插入打开的夹子并使其迅速闭合，造成挫伤性损伤。夹子的闭合力度和闭合持续时间决定了损伤强度和压迫程度。常用的夹力范围为15–35 g，夹闭时间通常为1分钟（图1）。
11. 移除夹子后，分两层缝合肌肉组织并关闭切口。
12. 停止麻醉，持续观察动物直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。最后将大鼠放入单独笼具，并遵循术后治疗指南进行管理。
13. 由于动物对此类损伤的耐受性较差，必须特别关注术后处理：
    1. 给予镇痛药物（布托啡诺使用3天，美洛昔康使用5天，具体根据临床症状调整）。
    2. 术后3天内皮下注射生理盐水（每日2次，每次5–10毫升（ml））。
    3. 术前2天至术后7天在饮水中添加抗生素（e.g., 莫西沙星）。
    4. 每日2–3次手动挤压排尿，直至膀胱功能持续恢复。
    5. 每日至少一次观察手术动物的神经功能缺损情况和生理状态。

2. 注射SAPs和NPCs（损伤后14天）

1. 按照1.1至1.3所述诱导麻醉，将大鼠头部固定于立体定位仪中，拆除缝线或伤口夹，使用聚维酮碘和70%酒精对伤口及手术区域进行消毒。
2. 仔细分离椎旁肌，插入牵开器，在显微镜下清除硬脊膜上的瘢痕组织，重新暴露损伤部位。
3. 以1%（w/v）浓度配制自组装肽（SAPs），用于形成细胞外基质凝胶。QL6 SAPs具有生理相容的pH值，注射前无需缓冲。为在脊髓中可视化SAPs，可使用QL6的荧光衍生物（QL6-异硫氰酸荧光素[FITC]）。
4. 将SAPs注射至损伤中心，总体积为5微升（μl），分两部分注射，每侧中线旁各2.5 μl。使用连接于立体定位仪的Hamilton注射器，配以微细玻璃毛细管（外径[OD]为100微米[μm]）。用锐针针尖小心切开硬脊膜，将玻璃毛细管立体定向插入受损脊髓组织深2毫米（mm）处。
5. 注入1/3体积后，将针头退至1.5 mm深度；再注入1/3体积后，进一步退至1 mm深度。注射全部体积后，在拔出注射器前等待5分钟，以确保凝胶形成稳定。
6. 为获取神经前体细胞（NPCs），使用成年Discosoma红色荧光蛋白（DsRed）小鼠（或黄色荧光蛋白[YFP]阳性小鼠，绿色），并从脑室下区分离和培养这些细胞。
7. 通过台盼蓝染色评估NPCs的存活率，结果显示细胞悬液中约有90%为活细胞。将细胞用生长培养基稀释至50 × 10³个活细胞/μl，随后用于细胞移植。
8. 在损伤部位头侧和尾侧各2 mm处，双侧共进行四次脊髓内注射，每次2 μl（总体积8 μl），共含4 × 10⁵个NPCs。切开硬脊膜后，将Hamilton微玻璃毛细管插入脊髓背侧表面以下1.5 mm处，注入2 μl细胞悬液。注射速率选择约0.5 μl/min（分钟）。
9. 每次注射结束后，在拔出毛细管前至少等待1分钟，以使组织充分延展，适应新增的细胞体积。（图2）

结果

图1：夹闭挫伤/压迫性动脉瘤模型。 (A) 大鼠C7/T1椎板切除术后，通过手术显微镜拍摄的脊髓夹闭挫伤/压迫部位照片。(B) 带有环形弹簧的夹子图片，该弹簧可确保精确的闭合压力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动脉瘤夹	SharpTech
手术显微镜	Leica
显微注射系统	World Precision Instruments, Inc.
小型动物立体定位仪	David Kopf Instruments
哈密顿注射器	Hamilton公司
手术器械	精细科学工具
异氟烷 USP	加拿大制药合作伙伴公司
0.9% 氯化钠注射液 USP	Baxter
7.5% 聚维酮碘	普渡制药
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField 乙醇公司
QL6 SAP	Covidien