神经回路的光遗传学作用于小鼠睡眠到清醒的转变

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1. 动物手术、病毒注射、脑电图/肌电图电极和光纤植入

：应根据所用病毒的生物安全水平选择适当的保护和处理技术。腺相关病毒（AAV）应在隔离的P1A分级室中进行注射，在所有体积用完后，必须用高压灭菌器灭菌携带AAV的管子。手术部位和所有植入材料在使用过程中应清洁无菌。

注意：参见图 1。

1.用高压灭菌器对手术设备进行消毒。

2.使用麻醉蒸发器用异氟醚麻醉小鼠。观察直到小鼠达到所需的麻醉深度，这是由用镊子捏住尾巴的反应丧失决定的。在眼睛上涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。

3.用碘溶液或70%乙醇（EtOH，3x）对手术区域进行消毒并充分干燥。在进行手术时让病毒在冰上解冻。用吸水性实验室台纸覆盖手术区域。

4. 用耳杆和鼻子捏住将鼠标的头部固定在立体定向装置中。确认头部稳固后，在头皮上做一个矢状中切口，确保头皮和lambda的位置在水平线上位于同一水平面。

5. 为避免定位间隙，适当上下调整鼻夹和耳杆的水平。前裂和lambda分别是指紧缩缝和冠状缝或lambdoidal缝之间的交点（图2）。

6. 使用塞拉芬夹夹住皮肤以保持与颅骨的接触。暴露颅骨后，用碘或5%H₂O₂对颅骨表面进行消毒，以使颅骨缝合线（包括bregma和lambda）更清晰地可视化。

7. 准备 AAV 载体注入：

1。用70%EtOH，100%EtOH和灭菌水依次清洗10mL注射器内部（见 材料表），各5次。将注射器固定在显微注射泵臂的夹子中，并确保注射器中的所有溶液都排出。

2. 小心地吸出 2 μL 没有气泡的矿物油，然后吸出指定体积的病毒溶液。抽吸后，作柱塞按钮并确认病毒溶液出现在针尖处。

注意：病毒溶液的注射量是在使用相同小鼠品系和相同病毒产品的中试实验中确定的。应提前估计病毒溶液的体积与感染区域范围之间的关系。

8. 注入 AAV vector：

1。调整显微注射针头在前萵上，并记下坐标作为原点。将针尖移动到指定的注射部位（对于 BNST：前后 + 0.2 毫米，内外侧 ± 1.0 毫米，背腹 - 4.2 毫米），并将针尖置于该位置。在头骨上做一个标记，然后使用带有 0.7 毫米硬质合金刀具的牙钻钻直径约 2 毫米的孔。小心不要损坏硬脑膜或脑组织。

2. 用棉签从孔周围去除血液后，慢慢将针头移至 BNST 的位置。用机械显微注射器缓慢注射指定量的病毒溶液（0.07μl/min）。完成注射后，将针头放置5分钟，让溶液充分浸润BNST组织。小心地取出针头。

3. 对于双侧注射，在另一侧重复步骤 1.8.1-1.8.2。在整个过程中，使用无菌盐水以保持头骨湿润。

注意：我们使用定制的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）植入物（宽度：5毫米，深度：7毫米，高度：1毫米），带有四个脑电图电极（4毫米），两个肌电图电极（2毫米;用钳子将4毫米电极切割到2毫米）和6个电极（4.5毫米）（图2A）。

9. 焊接两根不锈钢丝（见 材料表），从两端剥去 1 毫米的绝缘层到 EMG 电极。将电极中心调整到前蛭，标记每个脑电图电极的位置（前后±1.5mm，内侧±1.0mm），并确定植入物的位置（图2B）。

10. 植入光纤：

1.将光纤套圈连接到机械手并旋转机械臂，使其与水平线成 ±30° 的角度（此过程仅用于避免电极和光纤之间的干扰，例如在 BNST 刺激的情况下）。将纤维尖端放在前裂纹上并记录坐标。

2. 将尖端移动到目标插入线并在头骨上标记位置。此外，在地脚螺钉的插入部位附近放置额外的标记。用牙钻在每个部位钻头骨，插入光纤并固定螺钉。将螺丝固定在头骨上。小心不要用螺钉折断硬脑膜或损坏任何组织。

3. 轻轻插入光纤，直到用机械手到达 BNST 上方。套圈应靠在剩余的颅骨上（图1B）。

4. 涂上光固化牙科水泥（参见 材料表）覆盖纤维和螺钉。凝固胶水的反应时间应由制造商手册指定（我们的材料需要使用特定波长的光电发生器暴露在光线下至少 10 秒钟。之后没有必要干燥胶水）。

5. 在此步骤中，确保没有材料（螺钉或胶水）占用电极的安装空间。此外，避免在连接到光纤和电缆的套圈中中断水泥。在另一侧重复步骤 1.10.1-1.10.4 进行双侧刺激。

11. 为脑电图/肌电图电极钻孔。将电极的尖端插入孔中。握住植入物并将氰基丙烯酸酯粘合剂涂在颅骨和电极之间的空间上。再次插入时注意不要干扰任何材料。

12.用氰基丙烯酸酯粘合剂覆盖电极和光纤的圆周，然后在粘合剂上涂上氰基丙烯酸酯促进剂。此步骤可避免在套圈到光缆和电极到引线连接区域造成任何中断（图 1C）。

注意：氰基丙烯酸酯粘合剂及其促进剂对小鼠眼睛有害。注意不要造成这些化学物质的溢出。此外，请注意不要强烈接触电极和纤维，以免粘合剂凝固后立即出现意外偏差。

13. 露出鼠标颈部肌肉，将肌电图电极的导线插入肌肉下方。调整肌电图电极的长度，使其位于颈部肌肉下方。电极尖端和肌肉筋膜之间的轻微连接足以捕捉肌电图信号。

14.涂上氰基丙烯酸酯粘合剂填充种植体，并用加速液固化粘合剂。然后，将鼠标放在加热垫上进行恢复，直到出现姿势反射。将加热垫温度调节至动物静息体温（对于 C57BL6 小鼠，ZT 0-12 中为 36.0 °C，不要超过 38.0 °C）。

注意：无菌手术不需要抗生素。遵循您当地的术后镇痛机构指南。将小鼠放在家庭笼子中至少7天的恢复期。

2. 在特定睡眠状态下对目标神经元进行光激发的脑电图/肌电图监测

：该协议包括使用 3B 类激光设备或 LED 设备。实验者应了解安全信息。需要防护护目镜。

1. 在将激光电缆连接到光纤之前，请用洁牙机调节激光强度。用套圈将激光电缆的尖端拴在未使用的光纤上，并确认光纤和电缆之间的连接处没有空间。

2. 打开激光器的总开关，等待 20 分钟使其预热。

3. 将激光发射到强度检查器，并将激光强度调整为 10 mW/mm².将激光模式更改为晶体管逻辑，并确认光脉冲从由模式调节器控制的光纤发射，持续时间设置为 10 ms，静止设置为 40 ms，循环设置为 20 次，重复 20 次（即 20 Hz 的 10 ms 光脉冲持续 20 s）。

4.恢复期后，将小鼠移至实验室记录脑电图/肌电图。将家鼠保持在恒定的23°C，光/暗循环为12小时，食物和水随意可用。

5. 连接固定在滑环上的植入电极和电缆适配器，以避免缠绕。建议用铝箔等不透光材料覆盖连接处，以防止激光泄漏。如果需要进行双侧实验，请使用带有分叉附件的滑环来连接电缆。

6. 在本协议中，我们评估非快速眼动 （NREM） 睡眠或快速眼动 （REM） 睡眠的觉醒潜伏期，因此记录时间应限制在优化的时代时间（ZT0 定义为灯亮的时间）。该协议在 ZT4 - ZT10 之间进行。让小鼠在实验室中自由停留至少1小时以适应环境。

7.在实验期间，在同一台显示器中监测脑电图和肌电图信号，并评估小鼠的状态为清醒、NREM睡眠或REM睡眠。使用每个波的增益控制可以更轻松地区分每个状态。

8. 为了测量 NREM 睡眠到清醒潜伏期，观察 40 秒的稳定 NREM 睡眠或 30 秒的稳定 REM 睡眠，然后打开模式发生器的开关进行光刺激（该协议产生 20 Hz 的 10 ms 光脉冲 20 秒）。确认激光发射到植入的光纤。

9. 记录脑电图/肌电图信号，直到睡眠状态变为清醒状态。如果需要两次或更多实验试验，请将光遗传学作限制在每天一次，因为光刺激是一种可能影响睡眠/觉醒结构的人工干预。

10.实验结束后，用无菌生理盐水和多聚甲醛（PFA）深度麻醉灌注，对全脑取样进行免疫组化分析。

图 1：注射 AAV、植入光纤和 EEG/EMG 植入物的程序。（A）病毒注射的实验程序。将 EYFP 融合的 ChR2 或 EYFP（用于对照）基因掺入 AAV 载体中，其转录被 Cre 重组酶激活，双侧注射到 BNST 中。（B）将光纤以与水平面成30°角朝向BNST插入，以防止与电极碰撞。在它周围插入了两个螺钉。（C） 在安全放置光纤后植入脑电图/肌电图记录装置。（D）手术结束时，应用氰基丙烯酸酯粘合剂覆盖整个手术区域并牢固固定。确保不要在连接电极和套圈的区域涂抹任何试剂。

图 2：自定义脑电图/肌电图电极和电极引脚插入位点。（一）顶部：在 6 个电极引脚中，外部两个引脚被切割成 2 毫米。底部：脑电图/肌电图电极。 （B） 然后焊接这些电极和肌电图导线。连接区域应使用任何绝缘材料（如氰基丙烯酸酯粘合剂）隔离。电极的插入部位相对于前辫（前后± 1.5 毫米，中外侧± 1.0 毫米）。将肌电图导线插入颈部肌肉下方，去除插入部位（1 毫米）保护导线的绝缘层。