来源：Kodani, S.，等．在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控．J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了对小鼠从睡眠到觉醒转换过程中相关神经回路进行光遗传学操控的方法。该操作包括通过手术将光纤和电极分别植入脑内和肌肉，以实现光刺激和电生理记录。通过向终纹床核（BNST）中表达光敏感阳离子通道的神经元递送光照，调控其神经元活动，从而使得研究人员能够分析与诱导觉醒相关的脑部和肌肉信号。
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光遗传学操控小鼠睡眠到觉醒转换中的神经环路
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2025年8月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 动物手术、病毒注射、脑电/肌电电极及光纤植入
注意：应根据所用病毒的生物安全等级选择适当的防护和操作技术。腺相关病毒（AAV）应在专用于注射的隔离P1A级实验室内操作，使用完毕后携带AAV的试管必须经高压灭菌处理。手术部位及所有植入材料在使用过程中应保持清洁和无菌状态。
注意：参见 图1。
1. 使用高压灭菌器对手术器械进行消毒。
2. 使用麻醉蒸发器通过异氟烷对小鼠进行麻醉。观察小鼠直至其达到所需的麻醉深度，以镊子夹尾无反应为判断标准。在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
3. 用碘溶液或70%乙醇（EtOH，3次）消毒手术区域，并充分干燥。手术过程中将病毒置于冰上使其解冻。用吸水性实验台纸覆盖手术区域。
4. 使用耳杆和鼻夹将小鼠头部固定在立体定位仪上。确认头部稳定固定后，在头皮上做正中矢状切口，以确保前囟和后囟的位置位于同一水平线上。
5. 为避免定位间隙，需适当上下调节鼻夹和耳杆的高度。前囟（bregma）和后囟（lambda）分别指矢状缝与冠状缝或人字缝的交点（图2）。
6. 使用Serafin钳夹住皮肤以保持对颅骨的暴露。暴露颅骨后，用碘液或5% H2O2对颅骨表面进行消毒，以便更清晰地观察颅骨缝，包括前囟（bregma）和后囟（lambda）。
7. 准备腺相关病毒载体注射：
1. 用70% EtOH、100% EtOH和无菌水依次清洗10 mL注射器（参见材料表），每种溶液各清洗5次。将注射器固定在显微注射泵臂的夹具上，并确保排出注射器内的所有液体。
2. 小心吸取 2 µL 矿物油，避免产生气泡，然后吸取指定体积的病毒溶液。吸取完成后，推动活塞按钮，确认病毒溶液从针尖处流出。
注意：病毒溶液的注射体积是通过使用相同小鼠品系和相同病毒产品的预实验确定的。应预先评估病毒溶液的体积与感染区域范围之间的关系。
8. 注射 AAV 载体：
1. 将显微注射针尖调整至前囟点，记录此处坐标作为原点。将针尖移至指定注射位点（对于终纹床核：前后方向 +0.2 mm，内外侧 ±1.0 mm，背腹方向 -4.2 mm），并将针尖置于该位置。在颅骨上做标记，使用带有0.7 mm碳化钨钻头的牙科钻头钻出直径约2 mm的孔。注意避免损伤硬脑膜或脑组织。
2. 用棉签清除孔洞周围的血液后，缓慢将针头插入终纹床核（BNST）位置。使用机械微量注射器以指定剂量（0.07 µl/min）缓慢注射病毒溶液。注射完成后，将针头留置5分钟，以使溶液充分渗入BNST组织，随后小心拔出针头。
3. 对于双侧注射，在另一侧重复步骤 1.8.1-1.8.2。整个操作过程中，使用无菌生理盐水保持颅骨湿润。
注意：我们使用了定制的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）植入装置（宽度：5 mm，深度：7 mm，高度：1 mm），包含四个 EEG 电极（4 mm）、两个 EMG 电极（2 mm；用镊子将 4 mm 电极剪至 2 mm）以及 6 个电极（4.5 mm）（图 2A）。
9. 将两根不锈钢丝（参见材料表）的两端各剥去1 mm绝缘层后，焊接到肌电图（EMG）电极上。调整电极中心对准前囟，标记每个脑电图（EEG）电极的位置（前后方向 ± 1.5 mm，内外侧方向 ± 1.0 mm），并确定植入位置（图2B）。
10. 植入光纤：
1. 将光纤插芯连接至操纵器上，并旋转操纵器臂，使其与水平线成 ±30° 角（此步骤仅用于避免电极与光纤之间的干扰，例如在BNST刺激的情况下）。将光纤尖端置于前囟，记录坐标。
2. 将尖端移至目标插入线，并在颅骨上标记位置。同时，在插入部位附近做额外标记以固定锚定螺钉。使用牙科钻在每个标记位置钻开颅骨，用于插入光纤并固定螺钉。将螺钉固定在颅骨上。注意不要刺破硬脑膜或损伤组织。
3. 使用操作器轻柔插入光纤，直至到达终纹床核（BNST）上方。光纤套管应置于剩余的颅骨上（图1B）。
4. 使用光固化牙科水泥（参见材料表）覆盖光纤和螺钉。胶水固化的反应时间应遵循制造商说明书中的规定（本实验所用材料需用特定波长的光源照射至少10秒。此步骤后无需干燥胶水）。
5. 在此步骤中，确保没有任何材料（如螺丝或胶水）占据电极的安装空间。此外，避免对连接光纤和电缆的套管所用的水泥造成任何中断。在对侧重复步骤 1.10.1-1.10.4，以实现双侧刺激。
11. 为脑电图（EEG）/肌电图（EMG）电极钻孔。将电极的尖端插入孔中。固定植入物，并在颅骨与电极之间的空隙处涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。再次插入时注意不要干扰任何材料。
12. 用氰基丙烯酸酯粘合剂覆盖电极和光纤的周缘，然后在粘合剂上涂抹氰基丙烯酸酯加速剂。此步骤可避免在插芯与光纤电缆以及电极与导线的连接区域产生任何中断（图1C）。
注意：氰基丙烯酸酯粘合剂及其促进剂对小鼠眼睛有害。请注意避免这些化学物质溢出。同时，应小心操作，避免用力触碰电极和光纤，以防粘合剂固化后立即发生意外偏移。
13. 暴露小鼠颈部肌肉，并将肌电电极的导线插入肌肉下方。调整肌电电极的长度，使其刚好位于项部肌肉下方。电极尖端与肌肉筋膜之间轻微接触即可捕捉到肌电信号。
14. 使用氰基丙烯酸酯粘合剂填充植入物，并用加速液固化粘合剂。然后将小鼠置于加热垫上恢复，直至姿势反射出现。调节加热垫温度至动物静息体温（对于C57BL6小鼠，在ZT 0-12期间为36.0 °C；温度不得超过38.0 °C）。
注意：无菌手术无需使用抗生素。请遵循当地机构关于术后镇痛的指导原则。将小鼠置于饲养笼中，恢复期至少为7天。
2. 特定睡眠状态下靶向神经元光激发的脑电图/肌电图监测
注意：本实验方案涉及使用3B类激光设备或LED装置。实验人员应了解相关安全信息。必须佩戴防护护目镜。
1. 在将激光电缆连接至光纤之前，使用衰减器调节激光强度。将激光电缆的末端用带有插芯的闲置光纤固定，并确认光纤与电缆连接处无间隙。
2. 打开激光器的主开关，等待20分钟使其预热。
3. 将激光发射至光强检测器，并将激光强度调节至10 mW/mm2。将激光模式切换为晶体管逻辑模式，并确认光纤在模式调节器控制下发出光脉冲，其参数设置为持续时间10 ms、间歇时间40 ms、循环次数20次、重复次数20次（即：20 Hz的10 ms光脉冲，持续20秒）。
4. 恢复期结束后，将小鼠转移至实验装置中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）。小鼠饲养在温度恒定为 23 °C 的环境中，光照/黑暗周期为 12 小时，可自由获取食物和饮水。
5. 将植入式电极与连接至滑环的电缆适配器相连，以避免缠绕。建议使用铝箔等避光材料包裹连接处，防止激光泄漏。如果需要进行双侧实验，请使用带有分叉连接装置的滑环来连接电缆。
6. 在本实验方案中，我们评估从小鼠非快速眼动（NREM）睡眠或快速眼动（REM）睡眠中恢复觉醒的潜伏期，因此记录时间应限制在优化的授时因子时间（ZT）内（ZT0 定义为开灯时间）。本方案在 ZT4 至 ZT10 期间进行。让小鼠在实验箱中自由活动至少 1 h 以适应环境。
7. 在实验期间，于同一监测器上同步观察脑电图（EEG）和肌电图（EMG）信号，并据此评估小鼠所处状态为清醒、非快速眼动睡眠（NREM睡眠）或快速眼动睡眠（REM睡眠）。通过调节各信号波形的增益控制，以更清晰地区分不同状态。
8. 测量非快速眼动睡眠（NREM）到觉醒的潜伏期时，先观察持续40秒的稳定NREM睡眠或持续30秒的稳定快速眼动睡眠（REM），然后打开模式发生器的开关以进行光刺激（该程序产生持续20秒、频率为20 Hz、脉宽为10 ms的光脉冲）。确认激光成功发射至植入的光学纤维。
9. 记录脑电图/肌电图信号，直至睡眠状态转变为觉醒状态。如果需要进行两次或更多次实验，每天仅限进行一次光遗传学操作，因为光刺激是一种人工干预，可能会影响睡眠/觉醒结构。
10. 实验结束后，对动物进行深度麻醉，并用无菌生理盐水和多聚甲醛（PFA）灌注，以完整取出脑组织用于免疫组织化学分析。
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结果
图1： 注射AAV、植入光纤以及EEG/EMG装置的操作流程。(A) 病毒注射的实验步骤。将携带EYFP融合的ChR2基因或EYFP（对照组）的AAV病毒载体注射至双侧BNST，该载体的转录由Cre重组酶激活。(B) 光纤以与水平方向成30°...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x1 光纤旋转接头 | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | 用于光遗传学 |
| 6 针插头 | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6 针插座 | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D 转换器 | Nippon koden | N/A | 模数转换器 |
| AAV_{10} -EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×10^{13}（基因组拷贝数/mL） | ||
| AAV_{10} -EF1a-DIO-EYFP | 5.82×10^{13}（基因组拷贝数/mL） | ||
| 氨苄青霉素 | Fuji film | 014-23302 | |
| 放大器 | Nippon koden | N/A | 用于 EEG/EMG 记录 |
| 麻醉蒸发器 | Muromachi | MK-AT-210D | |
| 自动注射器 | KD scientific | 780311 | |
| 碳化钨钻头 | Minitor | B1055 | φ0.7 mm，又称牙科钻头，与高速旋转微型电机配合使用 |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂（Aron alpha A）及加速剂 | Konishi | #30533 | |
| 牙科光固化灯 | 3M | Elipar S10 | |
| 环氧树脂粘合剂 | Konishi | #04888 | 用于6针插头与屏蔽电缆焊点周围的绝缘 |
| 光纤跳线（分支型） | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| GAD67-Cre 小鼠 | 由 Dr. Kenji Sakimura 提供 | Cre 重组酶基因被敲入到 Gad67 等位基因中 | |
| 哈密尔顿注射器 | Hamilton | 65461-01 | |
| 高速旋转微型电机套件 | FOREDOM | K.1070 | 与碳化钨钻头配合使用 |
| 连接套管 | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm 陶瓷材质 |
| 异氟烷 | Pfizer | 871119 | |
| 激光器 | Rapp OptoElectronic | N/A | 波长 473 nm |
| 激光强度检测仪 | COHERENT | 1098293 | |
| 激光刺激器 | Bio research center | STO2 | 文中称为脉冲发生器 |
| 带插芯的光纤 | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | 由 PennVector Core 提供 | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | 质粒 # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | 由 Dr. Karl Deisseroth 提供 | ||
| 跳线 | Doric | D202-9089-0.4 | 长度 0.4 m，用于连接激光器与旋转接头的激光传导光纤 |
| pHelper | Stratagene | ||
| 光固化牙科水泥 | 3M | 56846 | |
| Serafin 钳 | Stoelting | 52120-43P | |
| 屏蔽电缆 | mogami | W2780 | 与6针插座焊接，用于 EEG/EMG 记录 |
| 睡眠记录室 | N/A | N/A | 定制（21 cm × 29 cm × 19 cm），带水箱支架 |
| Sleep Sign 软件 | KISSEI COMTEC | N/A | 用于 EEG/EMG 分析 |
| 滑环 | neuroscience,inc | N/A | 用于 EEG/EMG 分析 |
| 不锈钢螺钉 | Yamazaki | N/A | φ1.0 × 2.0 |
| 不锈钢导线 | Cooner wire | AS633 | 直径 0.0130 英寸 |
| 带数字控制台的立体定位仪 | Koph | N/A | 型号 940 |
| 注射器针头 | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital Recorder 软件 | KISSEI COMTEC | N/A | 用于 EEG/EMG 记录 |
