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所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。
1. 刺激袖带电极制作
- 准备袖带管。
- 使用剃须刀片切割一根 2.5 毫米长的聚合物管。将镊子尖端或回形针插入管子，然后使用刀片在袖带一侧的管壁上纵向切开一条缝。
从- 管子上取下镊子，将一根大缝纫针穿过袖带的中线，垂直于长轴。将针头穿过狭缝（顶部）并插入对面的管子中心（底部）。在剩余的组装步骤中，将针头放入泡沫板中，将袖带固定到位。
在- 植入过程中缝合以固定袖带闭合。
- 将小缝纫针穿过袖带壁，在中线处，距离一侧顶部狭缝约 0.5 毫米。将针头从内部插入外部，以免损坏袖带管。将 2 厘米长的 6/0 缝合线穿过针眼插入针眼，然后将针头拉过管壁，将缝合线穿入袖带。
- 将线留在原位，取出针头，沿袖带中线在第一个孔下方约 0.5 毫米处穿过管壁刺出第二个孔。将缝合线插入针眼，然后将针头拉过管壁，再次将缝合线穿过袖带。
- 缝合线的两端现在应该位于袖带的外侧。调整缝合线，使从顶部孔延伸~1.5厘米，从底部孔延伸~0.5毫米。
在从- 下孔延伸的缝合线的短端涂抹少量 UV（紫外线）固化粘合剂，然后拉动较长的缝合线端，直到下尾几乎与管子的外壁齐平。使用紫外线棒固化粘合剂并将缝合线牢固地固定到位。
在- 袖带的另一侧重复步骤 1.2.1 到 1.2.3。
- 放置铂金：铱 （Pt：Ir） 导线。
- 用小缝纫针在袖口壁上打 4 个孔。每对孔应放置在距垂直中线约 0.5-0.8 毫米的位置，在袖带两侧的顶部狭缝处放置一个孔约 0.5-0.8 毫米。
注意： 为了最一致和准确地放置导线，请将针从内部插入到外部以打出所有孔， 以缝合线位置为指导。 - 再次插入缝纫针，这次通过铅孔 1 从外部到内部工作。将大约 0.5 厘米长的 7.5 厘米长的 Pt：Ir 线插入针眼，然后将针头拉过管子，将导线穿过袖带壁。调整电线，使袖带外侧延伸 ~4.5 厘米（图 1A）。
- 再次将针头插入导程孔 1，再次从外部到内部工作，另外将针头插入导程孔 2 正对面的导程孔 1。将 Pt：Ir 线较短（内）端的 ~0.5 cm 插入针眼，然后将针拉过管子，将导线穿过袖带壁。
注意： Pt：Ir 线的两端现在应该在袖带的外侧，并在狭缝边缘和穿过导线孔 1 形成线环（图 1B）。 - 重复步骤 1.3.1 到 1.3.3，将 Pt：Ir 导线穿过引线孔 3 和 4。
- 使用丁烷打火机，小心地从 Pt：Ir 末端从 5-6 毫米长度的绝缘层从引线孔 2 和引线孔 4.
上引出：小心地将引线的末端与袖带组件的其余部分隔离，以免损坏袖带。使用工具固定电线以避免受伤。 将袖- 带内的裸线对齐，将导线放置在最终位置。为此，轻轻拉动从 1 孔延伸的 Pt：Ir 电线的末端，直到电线的未绝缘部分与 1 孔齐平。对另一根引线重复上述步骤，以对齐穿过引线孔 3 和 4 的电线的未绝缘端。
在- 袖带外侧导线孔 1 和 3 处的线环上涂抹少量 UV 固化粘合剂。使用紫外线棒固化粘合剂并将引线固定到位。
- 使用小移液器吸头将未绝缘的 Pt：Ir 导线推到袖带的内壁上。引线就位后，剪断从引线孔 2 和 4 延伸的电线末端，使大约 1 毫米的电线延伸到袖带壁的外部。
将- 金属丝的 1 毫米尾部平放在袖带的外表面上，注意不要将它们缩短在一起。涂上少量紫外线固化粘合剂，仅覆盖两个尾部，并固化粘合剂以固定引线放置并提供电绝缘。
注意：重要的是用粘合剂完全覆盖外部暴露的 Pt：Ir 表面，以绝缘电线并避免脱靶刺激。
- 用缝合线固定将 Pt：Ir 导线固定到位。
- 从泡沫板上取下带有袖带组件的大针。将 3 厘米长的 6/0 缝合线穿过针眼，然后将针头拉过管子，将缝合线穿过袖带底部的中点。
- 切换到小缝纫针以完成缝合穿线，以固定 Pt：Ir 引线。将针头插入同一个中线孔，从内部到外部再次工作，以避免管道和导线变形。将缝合线的外尾插入针眼，并将针头拉过袖带壁，在袖带边缘形成一个缝合线环（图1C）。
注意：使用镊子并在显微镜下工作，以确保缝合线沿袖带的长轴定向并平放在管子上。此步骤可确保导线在袖带内侧保持分离，并固定在袖带中线的外侧。 - 通过在袖带的外侧将缝合线的末端打成半结，在袖带的另一端形成第二个环。确保缝合线沿着袖带的长轴延伸并平放在管子上。在紧紧握住结以使其平放在管道上的同时，在半结上涂上少量紫外线固化粘合剂并固化以固定到位。
- 小心地将缝合线的末端剪得尽可能靠近结。如有必要，使用少量额外的紫外线固化粘合剂粘合缝合线的短端，使它们平放在管子上（图1D）。
将- 连接器引脚焊接到 Pt：Ir 引线上。
- 使用丁烷打火机，去除每个 Pt：Ir 导线末端 ~3 mm 的绝缘层。将金针的杯面（参见 材料表）焊接到每根引线的未绝缘端。
- 测试组装设备的阻抗。
- 将金引脚连接到LCR（电感（L）、电容（C）和电阻（R））表或电极阻抗检查模块的输入端，并将测试频率设置为1 kHz。将袖带管（以及袖带内部的 Pt：Ir 刺激触点）浸入装满盐水的小烧杯中，注意保持金引线针和探头连接器干燥。在继续植入之前，验证组装好的袖带在 1 kHz 处的阻抗是否小于 2 kΩ。
注意：高阻抗通常表示暴露的 Pt：Ir 表面积不足，这可能是由于绝缘层去除不足、袖带内部意外使用粘合剂、断线、 等。还应检查袖带是否有断裂或放置不当的线绞线，这些线绞线可能会导致长期使用时触点短路。
2. 头盖结构
注意：头盖组装程序与之前发布的程序类似，为方便起见，此处进行了总结。
- 组装头盖
切割- 两小块 30 AWG（美国线规）绕线，一小块长 ~13 毫米，一块长 ~10 毫米。从两根电线的每一端剥去 ~1.5 毫米的绝缘层。将金针的引脚侧焊接到每根电线的一端，尽可能靠近杯子。使用剪线钳切断焊点之外多余的引脚长度。
将 - AWG 电线的另一端焊接到 4 针微带连接器的两个中央焊杯上。
- 将电线头盖向上弯曲到连接器上，并将金针平放在连接器上，彼此平行，如图 2A 所示。连接到较短电线的引脚应放置在连接到较长电线的引脚下方。使用指甲丙烯酸、牙科水泥或紫外线固化粘合剂将头盖引线固定到位。
3. 设备使用
- 植入袖带电极以刺激慢性迷走神经。
注意：所有外科手术都应根据 NIH（美国国立卫生研究院）实验动物护理和使用指南，在适当的麻醉下使用无菌或无菌技术进行，并获得当地 IACUC（机构动物护理和使用委员会）的批准。以下过程旨在说明设备的代表性用法，并不全面。将- 大鼠置于立体定向框架中，并在顶骨和枕骨上做一个矢状切口，以露出颅骨表面，以便植入头帽/连接器。小心地在头骨上钻 4 个孔，然后放置珠宝商的螺丝。使用牙科亚克力将头盖固定到头骨和螺钉上。
将- 大鼠从立体定位框架中取出并将其放在右侧。在颈部左侧的皮肤上做一个垂直切口，小心地从颈动脉上解剖左迷走神经，颈动脉位于胸乳突肌和胸骨舌骨肌之间，舌骨肌下方。
将- 袖带皮下通向颅骨。使用金针将引线连接到头盖。
将- 迷走神经放入袖带内，并通过在袖带缝合线上打一个双结来固定装置闭合。小心避免在植入过程中用钝的、不导电的钩子纵神经或抓住神经周围的结缔组织来损伤神经。
- 通过对设备施加刺激来测试植入物（0.8 mA、30 Hz、100 μs 双相脉冲的 10 秒序列）。正确的植入将导致呼吸停止和 SpO2（外周毛细血管氧饱和度）下降 5% 或更多。
用- 牙科丙烯酸覆盖金针和裸露的导线，用缝合线缝合伤口，并用生理盐水、酒精和聚维酮碘溶液清洁切口部位。
根据 - NIH 指南和 IACUC 批准提供替代液体、镇痛药和术后护理。
在- 清醒行为中刺激迷走神经。
注意：在动物执行特定运动任务时传递 VNS（迷走神经刺激）先前已被证明可以扩展与任务相关的肌肉组织的运动图表示。我们使用这个经过验证的范式来提供设备使用的代表性示例，但许多其他行为范式和/或刺激参数可能与替代应用相关。在设备植入之前，大鼠被训练成精通此处使用的杠杆按压任务。术后，在VNS交付之前再次验证了良好的性能：大鼠在每天两次30分钟的训练中进行了至少100次成功的试验。在 5 天内的 10 次后续训练中，VNS 与正确的杠杆按压配对。- 通过植入的头帽将大鼠连接到刺激发生器，并调整到适当的刺激设置。对于VNS诱导的运动皮质图重组，将每个正确的杠杆按压与15个双相脉冲的单列配对，每个脉冲的宽度为100μs，幅度为800μA，以30Hz的频率传递。
在- 检测到每次成功的杠杆按下后，都会立即进行刺激列车，持续十次 30 分钟的训练课程。在 VNS 输送过程中，使用示波器监控电流刺激的成功输送。
- 验证长期植入的袖带功能。
在- 最后一次 VNS 配对训练后的 24 小时内，使用颅内显微刺激 （ICMS） 量化运动皮层中的功能性躯体图。
在- 诱导麻醉以对运动皮层进行ICMS映射后，通过施加10秒的30 Hz，0.8 mA电流刺激（100 μs双相脉冲）再次验证袖带功能，这应该会导致呼吸停止和SpO2水平降低至少5%，与Hering-Breuer反射一致。
注意： 根据应用的不同，如果观察到可靠的 SpO2 下降小于 5%，或者如果更高的电流幅度（高达 1.6 mA）可靠地使 SpO2 至少降低 5%，则袖带功能可能被认为是可以接受的。未能观察到呼吸停止和/或 SpO2 可靠下降表明种植体失败。
