通过慢性植入的外周神经袖带电极对大鼠进行迷走神经刺激

摘要

来源：Sanchez, C. A., et al．大鼠慢性植入用外周神经刺激电极的制备．J. Vis. Exp．（2020）．

本视频展示了在清醒大鼠中进行的迷走神经刺激。一只植入了慢性外周神经套管电极并经过杠杆按压任务训练的大鼠，通过植入的头部连接帽与刺激发生器相连。每次成功按压杠杆后立即刺激迷走神经，从而导致运动图谱的扩展。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 刺激袖状电极的制备

1. 准备套管导管。
   1. 使用剃刀刀片，截取一段长度为 2.5 mm 的聚合物导管。将镊子尖端或回形针插入导管中，用刀片沿导管一侧管壁纵向切开一条裂口。
   2. 从导管中取出镊子，将一根粗缝纫针穿过套管中线，方向垂直于其长轴。将针从裂口（顶部）穿入，并穿过导管中心对侧（底部）。将针插入泡沫板中，以在后续组装步骤中固定套管位置。
2. 植入过程中使用缝线固定套管闭合处。
   1. 用细缝纫针在套管一侧距顶部裂口约 0.5 mm 的中线位置刺穿管壁。为避免损伤套管导管，应从内向外穿刺。将一段长约 2 cm 的 6/0 缝线穿过针眼，并将针拉出导管壁，使缝线穿入套管内。
   2. 保持缝线就位，取下针头，并沿套管中线在第一个孔下方约 0.5 mm 处再次穿刺第二个孔。将缝线穿过针眼，将针从导管壁穿出，再次将缝线穿入套管。
   3. 此时缝线两端均应位于套管外侧。调整缝线长度，使上孔处伸出约 1.5 cm，下孔处伸出约 0.5 mm。
   4. 在从下孔伸出的较短缝线末端涂少量紫外光（UV）固化胶，然后拉动较长一端的缝线，使下端尾部几乎与导管外壁齐平。使用 UV 手持灯固化胶水，牢固固定缝线。
   5. 在套管另一侧重复步骤 1.2.1 至 1.2.3。
3. 放置铂:铱（Pt:Ir）导线电极。
   1. 使用细缝纫针在套管管壁上打四个孔。每对孔应位于垂直中线两侧约 0.5–0.8 mm 处，且在套管两侧距顶部裂口约 0.5–0.8 mm 处各有一个孔。
      警告：为确保电极位置最一致且准确，应以内向外方向穿刺所有孔，并以缝线位置作为引导。
   2. 再次插入缝纫针，此次从外向内穿过第 1 号电极孔。将一段 7.5 cm 长的 Pt:Ir 导线约 0.5 cm 长度穿过针眼，拉出针头，使导线穿过导管壁。调整导线，使其在套管外侧伸出约 4.5 cm（图 1A）。
   3. 再次从外向内穿过第 1 号电极孔，并将针同时穿过正对第 1 号孔的第 2 号电极孔。将 Pt:Ir 导线较短（内侧）端约 0.5 cm 长度穿过针眼，拉出针头，使导线穿过两个管壁。
      注意：此时 Pt:Ir 导线两端均应在套管外侧，导线在裂口边缘形成一个环，并穿过第 1 号电极孔（图 1B）。
   4. 重复步骤 1.3.1 至 1.3.3，将 Pt:Ir 导线穿过第 3 和第 4 号电极孔。
   5. 使用丁烷打火机，小心去除从第 2 和第 4 号电极孔伸出的 Pt:Ir 导线末端 5–6 mm 长度的绝缘层。
      警告：需小心将导线末端与套管其余部分隔离，避免损伤套管。使用工具夹持导线，防止受伤。
   6. 在套管内部调整裸露导线位置，使电极到达最终位置。轻轻拉动从第 1 号孔伸出的 Pt:Ir 导线末端，使导线未绝缘部分与第 1 号孔齐平。对另一根导线重复此操作，使穿过第 3 和第 4 号电极孔的导线未绝缘端对齐。
   7. 在套管外侧第 1 和第 3 号电极孔处的导线环上涂少量紫外光固化胶，使用 UV 手持灯固化胶水，固定电极位置。
   8. 使用细小移液器吸头将未绝缘的 Pt:Ir 导线电极压紧至套管内壁。待电极就位后，剪断从第 2 和第 4 号电极孔伸出的导线末端，使其在套管外壁外侧保留约 1 mm 长度。
   9. 将导线 1 mm 长的尾部平贴折叠在套管外表面，注意不要将两根尾部压在一起。涂少量紫外光固化胶完全覆盖两根尾部，并进行固化，以固定电极位置并提供电绝缘。
      警告：必须用胶水完全覆盖暴露在外的 Pt:Ir 表面，以实现导线绝缘，避免非靶向刺激。
4. 使用缝线固定 Pt:Ir 导线电极位置。
   1. 将带套管组件的粗针从泡沫板上取下。将一段 3 cm 长的 6/0 缝线穿过针眼，并将针穿过导管，在套管底部中点处穿入缝线。
   2. 换用细缝纫针完成 Pt:Ir 电极的缝线固定。从同一中线孔穿入，仍以内向外方向操作，避免导管和导线电极变形。将缝线外侧尾端穿过针眼，拉出针头，在套管边缘形成一个缝线环（图 1C）。
      注意：使用镊子并在显微镜下操作，确保缝线沿套管长轴方向平贴于导管表面。此步骤可确保电极在套管内侧保持分离，并位于套管中线侧方固定位置。
   3. 在套管另一端外侧将缝线两端打半结，形成第二个环。确保缝线沿套管长轴方向并紧贴导管表面。在拉紧结的同时使其紧贴导管，涂少量紫外光固化胶于半结处并进行固化，以固定位置。
   4. 尽可能贴近结处小心剪断缝线两端。如有必要，可额外涂少量紫外光固化胶，将缝线短端粘牢，使其紧贴导管表面（图 1D）。
5. 将连接器插针焊接到 Pt:Ir 导线电极上。
   1. 使用丁烷打火机，去除每根 Pt:Ir 导线电极末端约 3 mm 长度的绝缘层。将金质插针的杯状端（见 材料表）焊接到每根导线的未绝缘端。
6. 测试组装器件的阻抗。
   1. 将金质插针连接至 LCR（电感（L）、电容（C）和电阻（R））表或电极阻抗检测模块的输入端，设置测试频率为 1 kHz。将套管导管（及套管内部的 Pt:Ir 刺激电极）浸入盛有生理盐水的小烧杯中，注意保持金质导线插针和探针连接器干燥。确认组装完成的套管在 1 kHz 下的阻抗低于 2 kΩ 后，方可进行后续植入操作。
      注意：高阻抗通常表明暴露的 Pt:Ir 表面积不足，可能由绝缘层去除不充分、套管内部误涂胶水、导线断裂等因素引起。还应检查套管是否存在断裂或放置不当的导线，这些可能导致长期使用中出现短路接触。

2. 头部固定帽制作

注意：头帽组装步骤与先前已发表的方法类似，此处为方便起见进行简要总结。

1. 组装头帽
   1. 剪取两段30 AWG（美国线规）的导线，一段长约13 mm，另一段长约10 mm。将每根导线两端各剥去约1.5 mm的绝缘层。将金针的一端焊接到每根导线的一端，尽量靠近焊杯。使用剪线钳剪去焊点以外多余的针脚部分。
   2. 将AWG导线的另一端分别焊接到4针微带连接器的两个中心焊杯上。
   3. 将导线头帽的引线向上弯折朝向连接器，并将金针平放在连接器表面，彼此平行，如图2A所示。连接较短导线的金针应位于连接较长导线的金针下方。使用指甲丙烯酸树脂、牙科水泥或紫外固化胶将头帽引线固定到位。

3. 设备使用

1. 植入套管电极以进行慢性迷走神经刺激。
   注意：所有外科手术均应在适当的麻醉条件下，采用无菌或无菌技术进行，并遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）《实验动物护理与使用指南》以及当地机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）的批准。以下操作旨在说明该设备的代表性使用方法，而非详尽的操作指南。
   1. 将大鼠置于立体定位仪框架中，在顶骨和枕骨上方做矢状切口，暴露颅骨表面，以便植入头帽/连接器。小心地在颅骨上钻四个孔，并置入珠宝商用螺钉。使用牙科丙烯酸树脂将头帽固定于颅骨及螺钉上。
   2. 将大鼠从立体定位仪中取出，使其侧卧于右侧。在左侧颈部皮肤做垂直切口，小心地从颈动脉之间分离左侧迷走神经，该位置位于胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间，并在肩胛舌骨肌下方。
   3. 将套管导线经皮下隧道引向颅部。使用金针将导线连接至头帽。
   4. 将迷走神经置入套管内，并通过打双结固定套管缝线将其闭合。植入过程中应避免损伤神经，操作时应使用钝性非导电钩牵拉神经，或抓握神经周围结缔组织。
   5. 通过施加刺激测试植入效果（10秒脉冲串，0.8 mA，30 Hz，100 µs双相脉冲）。正确植入的表现为呼吸暂停，并伴随外周毛细血管血氧饱和度（SpO₂）下降5%或以上。
   6. 用牙科丙烯酸树脂覆盖金针及暴露的导线，缝合切口，并用生理盐水、酒精和聚维酮碘溶液清洁切口部位。
   7. 根据NIH指南和IACUC批准，提供补液、镇痛及术后护理。
2. 在清醒行为期间刺激迷走神经。
   注意：已有研究表明，在动物执行特定运动任务时施加迷走神经刺激（Vagus Nerve Stimulation, VNS），可扩大与任务相关的肌肉群在运动皮层图谱中的表征范围。我们采用这一经过验证的实验范式，以提供设备使用的代表性示例；但其他行为范式和/或刺激参数也可能适用于不同应用场景。本实验中，大鼠在植入设备前已接受训练，熟练掌握此处所用的杠杆按压任务。术后再次确认其表现良好：大鼠每日完成两次30分钟训练会话，每次至少成功执行100次试验。在随后连续5天的10次训练会话中，将VNS与正确的杠杆按压配对进行。
   1. 通过植入的头帽将大鼠连接至刺激发生器，并调整至适当的刺激参数。为诱导运动皮层图谱重组，每次正确杠杆按压后配对施加一串15个双相脉冲，每个脉冲宽度为100 µs，振幅为800 µA，频率为30 Hz。
   2. 在整个十次30分钟训练会话中，每次成功杠杆按压检测到后立即递送一串刺激。在递送VNS期间，使用示波器监测电流刺激是否成功传递。
3. 验证慢性植入套管的功能。
   1. 在最后一次VNS配对训练后的24小时内，采用颅内微刺激（intracranial microstimulation, ICMS）量化运动皮层的功能性躯体定位图谱。
   2. 在为ICMS绘制运动皮层图谱而诱导麻醉后，再次验证套管功能：施加10秒、30 Hz、0.8 mA的电流刺激（100 µs双相脉冲），应引起呼吸暂停并使SpO₂水平至少下降5%，符合赫林-布劳反射（Hering-Breuer reflex）特征。
      注意：根据具体应用，若观察到可靠但小于5%的SpO₂下降，或在较高电流振幅（最高达1.6 mA）下可靠地产生至少5%的SpO₂降低，则可认为套管功能可接受。若未观察到呼吸暂停和/或SpO₂的可靠下降，则提示植入失败。

结果

图1：刺激袖状电极的组装。 （A）在袖状电极两侧固定缝线后，使用缝合针将铂铱（Pt:Ir）导线从袖壁的#1孔（白色箭头）穿入。 （B）将铂铱导线在袖状边缘绕成环状，再经#1孔（白色箭头）穿回，并从#2孔（黄色箭头）横向穿过袖壁，完成导线穿引，准备去绝缘处理。 （C）当两根导线均就位后，将缝线穿过中线孔并绕过袖状边缘（黄色箭头），...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物相容性聚氨酯基聚合物导管，外径 0.080 英寸 × 内径 0.040 英寸	Braintree Scientific	MRE080 36 FT
解剖显微镜	AM Scopes	#SM-6T-FRL
精细锯齿剪刀，直型，22 mm 刃长	Fine Science Tools	#14058-09	用于剪切铂铱合金导线和缝合线
镊子，#5 Dumont 镊子，直型，11 cm，尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm	Fine Science Tools	#11626-11
镊子，陶瓷尖镊子，尖端尺寸 0.3 mm × 30 mm	电子显微科学公司（Electron Microscopy Sciences）	#78127-71
金针，PCB 压合插座	Mill-Max	#1001-0-15-15-30-27-04-0	或类似的小型针脚，用于连接套管引线与头帽
异丁烷打火机	BIC	#LCP21-AST	用于去除铂铱合金导线的绝缘层
带锁扣微型条形连接器，4 针	Omnetics	A24002-004 / PS1-04-SS-LT
移液器吸头，10 µL	VWR	89079-464
铂铱合金（90/10%）导线，直径 0.001 英寸 × 9 股，PTFE 绝缘	Sigmund Cohn	10IR9/49T
单刃手术刀片，碳钢手术刀片 No.9	VWR	#55411-050	用于切割 MicroRenathane 导管
缝纫针，长约 4.0 cm × 直径 0.7 mm（6–7 号）	Singer	276	较小的针，用于穿铂铱合金导线
缝纫针，长约 4.5 cm × 直径 0.8 mm（2–3 号）	Singer	276	较大的针，用于组装过程中固定套管以及穿缝合线
小型泡沫板	Juvo+/Amazon	B07C9637SJ	作为制作平台；我们的尺寸约为 2.5 英寸 × 3.5 英寸 × 1 英寸（长 × 宽 × 高）
焊锡，多芯无铅，直径 0.38 mm	Loctite/Multicore	#796037
焊接站	Weller	WES51	或类似可兼容长锥形焊嘴的电烙铁（该型号已停产）
焊锡头，长锥形，0.01 英寸 / 0.4 mm	Weller	1UNF8
缝线，不可吸收编织丝线，6/0 规格	Fine Science Tools	#18020-60
紫外光（405 nm）点光源	汉高/乐泰（Henkel/Loctite）	#2182207
紫外光固化胶粘剂，25 ml	汉高/乐泰（Henkel/Loctite）	AA 3106	或类似的生物相容性紫外光固化胶
绕线用导线，30 AWG	Digikey	K396-ND