利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

本文内容

摘要

本视频演示了通过病毒介导的基因转移将光敏感离子通道——视蛋白基因导入小鼠背侧耳蜗核（DCN），以实现光诱导的听觉刺激。在开颅并吸除小脑组织以直接暴露DCN后，将编码视蛋白的病毒载体注射至DCN。视蛋白表达后可使神经元对光产生反应而被激活，从而为利用光遗传学研究听觉通路的响应提供一种模型。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小脑抽吸

使用5 French吸引器，吸除覆盖在DCN上方的左侧小脑最外侧部分，直至DCN可见（图1，右图）。移除约左侧小脑的1/4至1/3。与DCN相邻的主要解剖标志是上半规管的壶腹。
注意：小脑的吸除是本方案的关键步骤。为避免出血，应尽量通过一次操作完成定向吸除，避免多次反复使用吸引器。为辅助吸除操作，可将显微镜的焦平面调节至预期的CN深度，该深度略位于小脑表面远端。将焦平面设为CN位置可改善视野并确保图像清晰。
吸除后，预期会出现进一步出血、脑脊液（CSF）积聚以及小脑对DCN的位移。此时应迅速向颅骨开窗处注入0.5 cc无菌生理盐水，以防止血液凝固。随后可结合使用牙科棉签轻柔擦拭和吸引，清除通路以实现对DCN的直接观察。切勿直接接触DCN表面。

2. 病毒介导的基因转移压力显微注射及手术恢复

当DCN表面的血液和脑脊液已被清除，且DCN清晰可见时，使用10 µl Hamilton注射器在2分钟内向DCN进行压力微注射。
使用显微操作器插入针头，直至针尖在DCN表面下不可见为止。
为获得最佳效果，建议使用33或34号针头（使用34号针头时需配用防漏注射器），针尖斜面较浅（例如45°），以尽量减少钝性损伤，并将注射体积局限在DCN内；DCN是脑干中一个较薄且表浅的结构（<300 µm厚）。
注意：也可使用其他微注射仪器。理想情况下，注射装置应具备足够的灵活性，以便在需要时可轻微弯曲，从而直接靶向DCN。此外，由于小鼠在手术过程中会因呼吸而产生轻微移动，该装置还应具备足够的稳定性，以耐受微小的移动。

3. 手术恢复

注射后立即缝合皮肤，并按照标准恢复程序让小鼠恢复。残留的小脑和瘢痕组织将填充因小脑抽吸所形成的空腔。需持续监测动物，直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。同时监测心率、呼吸频率以及摄食能力。
注意：任何接受手术的动物，在完全恢复前均不得放回与其他动物共处的笼具中。
若小鼠在术后出现转圈行走的情况（<5% 的病例），通常发生在皮肤切口闭合后 2–4 小时，应立即实施安乐死，因其摄食可能极为困难。该副作用很可能源于小脑的抽吸。术后应监测动物是否出现疼痛，并根据机构标准给予适当的麻醉性镇痛药物以确保动物福利。如出现感染迹象，可能需要使用抗生素。

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结果

图1：小脑部分吸除显示了进入耳蜗背核的通路。左图：将小鼠固定于固定装置后，沿颅骨后部至颈部软组织处垂直切开皮肤及软组织。将皮肤向两侧牵开，去除覆盖冠状缝线区域的肌肉。中图：随后使用骨钳在小脑及下方耳蜗背核所在区域进行颅骨开窗手术。右图：为暴露耳蜗背核，使用5 French吸引管吸...

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材料

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