通过大鼠模型中的迷走神经刺激减轻冻结行为

摘要

来源：Childs, J. E., 等．利用迷走神经刺激诱导与消退学习相关通路的可塑性．J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了在大鼠模型中通过迷走神经刺激（VNS）减轻僵直行为的方法。经过恐惧条件化的大鼠在声音再暴露期间接受迷走神经刺激，导致僵直行为减少，揭示了其治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 听觉恐惧条件反射

注意：该恐惧条件反射实验方案比大多数方案更为强化，因为这些实验的目的是增强消退效果。若采用较温和的恐惧条件反射，其容易被消退，则可能出现下限效应，从而掩盖这种增强作用。

1. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下 随意 自由获取食物和水。术后恢复期间每天处理动物。
2. 设置条件化和测试装置，该装置由一个放置在隔音箱内的操作箱组成（图1C操作箱具有透明塑料壁，尺寸为20 × 20 × 20 cm，底部为不锈钢网格地板，连接至足底电击发生器。使用白色房屋灯照亮箱体，以便进行视频记录。使用9 kHz、85 dB声压级（SPL）的声音作为条件刺激（CS）。
3. 使用位于操作箱上方腔室内的数字摄像机记录行为。在行为室外的计算机上查看和监控实验过程。保存视频以供后续分析。
4. 每次实验前后用70%乙醇擦拭实验腔室，以消除嗅觉线索。
5. 对大鼠进行为期2天的恐惧条件反射训练（图 2A）。通过在第一天呈现5次声音刺激（9 kHz，85 dB，持续30 s）来确认大鼠对声音本身无先天恐惧反应，确保其僵直水平可忽略不计。
   1. 在连续两天中的每一天，进行8次声音-足底电击（1秒，0.5 mA）配对刺激。第二天重复相同的配对过程。刺激间间隔（ISI）在2至4分钟之间变化，每次试验平均为3分钟。电击在声音刺激期间的出现时间点应随机化。
6. 第三天，检测音调/电击关联的强度。在无足底电击的情况下，播放4次音调，刺激间间隔（ISI）为3、4或5分钟（平均4分钟），记录动物在音调呈现期间及刺激间间隔期间的僵直行为，作为条件性恐惧反应（CFR）的测量指标。
7. 第4天，开始进行伴随迷走神经刺激（VNS）或假性迷走神经刺激（sham VNS）的消退训练。
   1. 将刺激器的公头连接器插入刺激输入端口，连接大鼠。将动物放入实验舱内（图1A, 1C）。将刺激器设置为0.4 mA，脉宽500 µs，频率30 Hz。刺激总持续时间为30.15 s，从声音开始前150 ms启动。向动物播放4个声音，并将每个声音呈现与VNS或假VNS配对。
8. 使用示波器定期检测套管和输入部位的电学完整性。
   1. 将动物正常连接，并将刺激器的输出分路至示波器。
   2. 将示波器的量程设置为 -20 V 至 +20 V，并开始刺激。30 Hz 刺激的波形应在示波器上可见。若刺激幅度超过 10 V，表明阻抗过高，袖带或刺激输入部位的连接存在功能异常。
9. 为了检验迷走神经刺激（VNS）对消退训练的影响，在第5天进行第二次条件性恐惧反应（CFR）测试。记录在声音刺激期间动物静止不动的时间，并将其与第一次CFR测试中记录的基线静止时间进行比较。
10. 使用对处理条件不知情的独立观察者分析视频。使用秒表测量大鼠在声音呈现期间的僵直时间。僵直定义为完全静止不动，期间大鼠表现出快速呼吸、低头和四肢伸展。对僵直行为的分析可分为两个阶段：声音呈现期间和刺激间间隔期间。

结果

图1. 迷走神经刺激与实验装置。（A）用于迷走神经刺激（VNS）的装置示意图。动物通过头帽连接至刺激隔离单元，头帽引出两条铂铱合金导线，经皮下通向定制的套管电极，该电极包裹在迷走神经周围。（B）套管电极在迷走神经周围的放置位置。手术切口及暴露的迷走神经在缝合套管电极前的显微照片。（C）用于听觉恐惧条件反射实验的装置照片，动物连接至刺激器。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚维酮碘	Henry Schein	69066950
数码相机 - 罗技网络摄像头 C210	Logitech	B003LVZO88
铂铱合金丝	Medwire	10IR9/49T
隔离式脉冲刺激器 型号 2100	A-M Systems	720000
Sinometer 10 MHz 单通道示波器	Sinometer	CQ5010C
Extech 407730 40-130 分贝数字声级计	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C 双输出随机电击器	Kinder Scientific Co