挤压伤后小鼠坐骨神经的轴突再生

1. 材料和试剂

1. 动物
   1. 使用体重 30-35 g 的六周龄雌性 CF1 小鼠进行实验。
      注意：将小鼠群居（每个笼子 5 只小鼠）放在单独通风的灭菌笼子中，笼子里有 1/4 英寸玉米芯垫料和 2 英寸方形雏鸟筑巢。笼子保持在受控的12 h明暗循环中，室温在19.4 °C和25 °C之间。小鼠被喂食全球啮齿动物饮食和自动供水系统。
2. Instruments
   1. 使用以下手术器械高效进行手术：腹腔注射用一次性注射器（27 G，1.0 mL）、毛皮剪、立体解剖显微镜、显微手术镊子、显微手术剪刀、小骨头和消毒无纺布海绵。
      注意：所有仪器和材料在手术前都经过高压灭菌或由生产商进行预灭菌。在手术过程中，器械会喷洒 75% 的酒精以保持无菌。
麻醉
3. 液
   1. 使用麻醉液 #1 诱导麻醉，并在注射背根神经节 （DRG） 前使用麻醉液 #2 维持麻醉。
      1. 要制备麻醉液#1，请在无菌盐水中稀释氯胺酮和甲苯噻嗪，终浓度为10mg / mL和1.2mg / mL。
      2. 要制备麻醉溶液#2，请在无菌盐水中以终浓度为20mg / mL稀释avertin。
4. DNA 质粒和 RNA 寡核苷
   按照
   1. 制造商的方案使用商业试剂盒制备质粒。在无菌去离子水中将质粒DNA稀释至2.0μg/μL的浓度。
   2. 加入 Fast Green 染料溶液，使其最终浓度达到 0.005–0.01% （v/v），以便在进样过程中更好地观察 DRG 轮廓。
   将
   3. 小干扰RNA（siRNA）或microRNA寡核苷酸（microRNA寡核苷酸）溶解在制造商提供的相应缓冲液中，以达到50μM的终浓度。
5. Micro-Injection Pipette
   1. 使用微量移液器拉拔毛细管玻璃，并用显微外科剪刀切割拉出的毛细管玻璃移液器的尖端，以产生一个外径约为50μm的开口。然后，在干净的工作台上在紫外线下对玻璃移液器进行消毒约 20-30 分钟。
   将
   2. 灭菌玻璃移液器安装在连接到细胞内显微注射分配系统的移液器支架上。将显微注射系统的参数设置为 30 psi 的压力和 8 ms 的持续时间。
电穿孔系统
1. 将电极连接到方波电穿孔系统并设置以下参数：体内电穿孔的 35 V 频率为 15 毫秒脉冲，间隔为 950 毫秒。
6. 灌注和固定溶液
   1. 将多聚甲醛 （PFA） 粉末溶解在浓度为 4% （w/v） 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。将PFA溶液储存在4°C。

2. 实验程序

1. L4 和 L5 DRG 的手术暴露
   1. 使用腹腔注射先前制备的麻醉液 #1（氯胺酮 100 mg/kg 体重和甲苯噻嗪 12 mg/kg 体重）麻醉小鼠。
   2. 用毛皮剪剃掉手术区域。
      注意：由于左坐骨神经挤压将进行另一次手术，因此可以同时剃掉左大腿后部的皮毛。
   将
   3. 鼠标放在加热毯（35.0°C）上，并用温度探头监测直肠温度。
   4. 要测试麻醉，请捏住小鼠的脚趾和尾巴并观察行为反应。
   将
   5. 鼠标的四个肢体粘在软木板上。
   6. 用碘伏溶液擦拭手术区域，然后在切割皮肤之前使用 75% 的酒精去除碘伏。
   在
   7. 麻醉下将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止干燥。
   8. 切口前，用细记号笔标记髂嵴的两侧。画一条连接髂嵴两点的线，以便于识别L5 DRG的位置。
   9. 用显微剪刀沿着下背部中线做一个 3 厘米的切口。此外，将棘旁肌，如多裂肌和腰最长肌，从L3至S1棘突分离，并暴露L4-5和L5-6的小关节。
   10. 使用微型管去除 L4-5 和 L5-6 的小关节。此外，去除L4和L5的左神经弓，露出DRG的背侧。
2. DRG注射
   在
   1. DRG注射前腹腔注射麻醉液#2（含avertin 200 mg/kg体重）以维持麻醉。
   将
   2. DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸（每个 DRG 1 μL）加载到玻璃毛细管移液器中。
   3. 小心地将毛细管玻璃移液器的尖端插入 DRG。
   4. 使用细胞内显微注射分配系统（30 psi，8 ms）将 1.0 μL DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸溶液逐渐注射到 DRG 中。
      注意：注射持续时间应不少于 5 分钟。
3. 电穿孔<ol style='list-style-type：decimal;'>将
4. PBS 滴在电极尖端。
5. 用消毒过的方形棉纱布清理出血。
用
6. 电极轻轻捏住目标DRG，并用电穿孔系统施加5个方形电脉冲。
分别
7. 用 5-0 尼龙缝合线闭合肌肉层和皮肤层。
将
8. 小鼠放在加热的毯子（35.0°C）上，密切注意，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。小鼠从麻醉中完全恢复后，将小鼠放回家庭笼子中。
   注意：小鼠大约需要60分钟才能从37°C毯子上的麻醉中完全恢复。将一粒（200 毫克）布洛芬溶解在 1,000 毫升水（0.2 毫克/毫升）中，用于日常喂养，以缓解术后疼痛。