小鼠坐骨神经挤压损伤后的轴突再生

摘要

来源： 李 Q. 等研究哺乳动物轴突再生： 体内 成年小鼠背根神经节的电穿孔 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了小鼠坐骨神经在挤压损伤后轴突再生的过程。分离的神经经过固定和成像前处理，并利用神经元中表达的荧光蛋白来观察轴突生长。通过落射荧光显微镜，追踪从损伤部位开始的轴突再生情况，以评估再生程度。

方案

1. 材料与试剂

1. 动物
   1. 使用6周龄、体重30–35 g的雌性CF1小鼠进行实验。
      注意： 小鼠以每笼5只的密度群养于独立通风的灭菌笼具中，笼内铺有1/4英寸玉米芯垫料，并提供2英寸见方的筑巢垫料用于筑巢。笼具环境维持在12小时光照-12小时黑暗的可控光周期条件下，室温保持在19.4 °C至25 °C之间。小鼠饲喂标准啮齿类动物饲料，并通过自动供水系统提供饮水。
2. 仪器
   1. 使用以下手术器械可高效完成手术：一次性注射器（27 G，1.0 mL，用于腹腔注射）、毛发剪、体视显微镜、显微外科镊、显微外科剪、小型咬骨钳以及无菌非织造海绵。
      注意： 所有器械和材料在手术前均经过高压灭菌或由生产商预先灭菌。手术过程中，器械需用75%酒精喷洒以维持无菌状态。
3. 麻醉溶液
   1. 使用麻醉液#1诱导麻醉，并在背根神经节（DRG）注射前使用麻醉液#2以维持麻醉状态。
      1. 配制麻醉溶液#1：将氯胺酮和赛拉嗪溶于无菌生理盐水中，终浓度分别为10 mg/mL和1.2 mg/mL。
      2. 配制麻醉溶液#2：将Avertin用无菌生理盐水稀释至终浓度为20 mg/mL。
4. DNA质粒与RNA寡核苷酸
   1. 使用商业试剂盒，按照制造商的说明书制备质粒。将质粒DNA用无菌去离子水稀释至浓度为2.0 µg/µL。
   2. 加入快绿染料溶液，使其终浓度为0.005–0.01%（v/v），以在注射过程中更清晰地显示背根神经节的轮廓。
   3. 将小干扰RNA（siRNA）或微小RNA寡核苷酸（microRNA oligos）溶解于生产商提供的相应缓冲液中，配制成终浓度为50 µM的溶液。
5. 显微注射移液管
   1. 使用显微拉针仪拉制毛细玻璃管，并用显微手术剪剪断拉制后的毛细玻璃移液管尖端，制成外径约50 µm的开口。随后，在超净台中将玻璃移液管置于紫外光下灭菌约20–30分钟。
   2. 将灭菌的玻璃移液管安装在连接细胞内显微注射分配系统的移液管架上。设置显微注射系统的参数为30 psi压力和8 ms持续时间。
6. 电穿孔系统
   1. 将电极连接至方波电穿孔系统，并设置以下参数：35 V电压，脉冲时长15 ms，间隔950 ms，进行电穿孔 体内 电穿孔
7. 灌流与固定液
   1. 将多聚甲醛（PFA）粉末溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成4%（w/v）的溶液。将PFA溶液于4 °C保存。

2. 实验步骤

1. L4 和 L5 背根神经节的手术暴露
   1. 通过腹腔注射先前配制的麻醉液 #1 对小鼠进行麻醉（剂量为氯胺酮 100 mg/kg 体重，赛拉嗪 12 mg/kg 体重）。
   2. 使用毛发剪刀剃除手术区域的毛发。
      注意：由于后续还需进行左侧坐骨神经 crush 手术，可同时剃除左侧后大腿的毛发。
   3. 将小鼠置于加热毯（35.0 °C）上，并使用温度探头监测直肠温度。
   4. 通过轻捏小鼠脚趾和尾巴来测试麻醉效果，并观察其行为反应。
   5. 用胶带将小鼠四肢固定在软木板上。
   6. 用碘伏溶液擦拭手术区域，然后在切开皮肤前用 75% 酒精去除碘伏残留。
   7. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
   8. 在切口前，使用细头记号笔标记双侧髂嵴位置，连接两侧髂嵴顶点画一条线，以帮助定位 L5 背根神经节的位置。
   9. 使用显微剪刀沿下背部正中线做一条长约 3 cm 的切口。从 L3 至 S1 棘突处分离椎旁肌（如多裂肌和腰最长肌），暴露 L4-5 和 L5-6 的关节突关节。
   10. 使用显微咬骨钳去除 L4-5 和 L5-6 的关节突关节，并切除左侧 L4 和 L5 的椎弓，以暴露背根神经节的背侧。
2. 背根神经节注射
   1. 在背根神经节注射前，通过腹腔注射麻醉液 #2（剂量为戊巴比妥钠 200 mg/kg 体重）以维持麻醉状态。
   2. 将 DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸（每背根神经节 1 µL）吸入玻璃毛细移液管中。
   3. 小心地将玻璃毛细移液管尖端插入背根神经节内。
   4. 使用细胞内微注射分配系统（30 psi，8 ms）缓慢向背根神经节内注射 1.0 µL 的 DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸溶液。
      注意：每次注射持续时间应不少于 5 分钟。
3. 电穿孔
   1. 在电极尖端滴加 PBS 溶液。
   2. 使用无菌方形棉纱布清除出血部位。
   3. 轻轻用电极夹住目标背根神经节，并使用电穿孔系统施加 5 次方波电脉冲。
   4. 分别使用 5-0 尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层。
   5. 将小鼠置于加热毯（35.0 °C）上密切观察，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回饲养笼。
      注意：小鼠在 37 °C 加热毯上完全恢复麻醉大约需要 60 分钟。将一片布洛芬（200 mg）溶于 1,000 ml 水中（0.2 mg/ml），用于术后每日饮水，以缓解术后疼痛。
4. 坐骨神经 crush 损伤
   1. 背根神经节电穿孔后 2 至 3 天（根据实验设计而定），通过腹腔注射麻醉液 #2（剂量为戊巴比妥钠 400 mg/kg 体重）对小鼠进行麻醉。
   2. 将小鼠四肢用胶带固定在软木板上。
   3. 沿正中线向左侧偏移 0.5 cm 处做一条长约 1 cm 的切口，纵向切开臀大肌和梨状肌，暴露坐骨大孔至坐骨切迹之间的坐骨神经段。
   4. 使用显微外科镊对神经进行 12 秒的 crush 损伤，并用 10-0 尼龙表层神经外膜缝线标记损伤部位。在硬膜上打结以标记 crush 位置。
   5. 使用 5-0 尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层。
   6. 将小鼠置于加热毯（35.0 °C）上密切观察，直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回饲养笼。
      注意：小鼠在 37 °C 加热毯上完全恢复麻醉大约需要 60 分钟。将一片布洛芬（200 mg）溶于 1,000 ml 水中（0.2 mg/ml），用于术后每日饮水，以缓解术后疼痛。
5. 小鼠灌流、背根神经节及坐骨神经取材
   1. 坐骨神经 crush 损伤后 2 至 3 天（根据实验设计而定），通过腹腔注射麻醉液 #2 对小鼠进行麻醉。
   2. 经心脏灌流 PBS（pH 7.4），随后灌注冰冻的 4% 多聚甲醛（PFA）（溶于 PBS，pH 7.5）。
   3. 灌流完成后，在解剖显微镜下使用显微剪刀和显微镊子小心分离包含神经根和膝上段坐骨神经的背根神经节。将坐骨神经直接置于 4% PFA 中，4 °C 下固定过夜。
6. 荧光标记感觉轴突的成像与测量
   1. 在解剖显微镜下，使用显微剪刀和显微镊子小心去除固定后的坐骨神经上附着的组织和膜结构。然后将 4% PFA 更换为 PBS，并清洗神经三次。
   2. 将坐骨神经放置于载玻片上并保持平直。在神经周围加入 80 µL 抗荧光淬灭剂溶液，盖上盖玻片，并施加压力使整体封片组织展平。
   3. 将展平的组织置于配备马赛克图像采集与图像处理附件的倒置落射荧光显微镜下进行观察。
      注意：激发波长和发射波长分别为 488 nm 和 509 nm。也可手动拍摄多张重叠图像，并使用 ImageJ 软件结合 Mosaic 插件进行图像拼接。
   4. 测量再生轴突长度时，从 crush 损伤部位（由 10-0 表层神经外膜缝线标记）开始，追踪坐骨神经中所有可识别的荧光标记轴突至其远端末端。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 方波电穿孔系统	BTX Harvard Apparatus	45-0052	用于体内电穿孔
镊状电极（Tweezertrodes electrodes）	BTX Harvard Apparatus	45-0524	用于体内电穿孔，1 mm 平头
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	细胞内微量注射给液系统
玻璃毛细管拉制仪	NARISHIGE	PC-10
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1902328
体视解剖显微镜	Leica	M80
显微外科咬骨钳	F.S.T	16221-14
显微外科镊	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	仅用于坐骨神经压伤
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm，标准壁厚
胶带	Fisherbrand	15-901-30	用于将小鼠固定在软木板上
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin 储存液
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463	Avertin 储存液
siRNA 荧光通用阴性对照 #1	Sigma-Aldrich	SIC003	非靶向荧光标记 siRNA
携带 Dy547 的 microRNA 模拟物转染对照	Dharmacon	CP-004500-01-05	非靶向荧光标记 microRNA
质粒制备试剂盒	Invitrogen Purelink	K210016	编码 GFP 质粒的制备
快绿染料	Millipore-Sigma	F7252	用于注射过程中更好地观察背根神经节轮廓
氯胺酮	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	麻醉诱导
赛拉嗪	AnaSed	NDC 59399-110-20	麻醉诱导
对乙酰氨基酚	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	术后镇痛