神经细胞悬液立体定向移植到创伤性脑损伤小鼠体内

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1. 细胞悬液立体定向移植

1. 骨切除术后约 24 小时开始细胞移植手术。
2. 准备细胞移植设备和手术用品
   用
   1. 无菌盐水填充 1 mL 滑头注射器用于伤口冲洗。将 25 G 针头连接到注射器以控制冲洗。
   用
   2. CsA（环菌素 A）溶液填充 1 mL 滑头注射器以进行免疫抑制。将 25 G 或更大的针头连接到 CsA 注射器上。在手术之间根据需要重新填充 CsA 注射器。
   3. 使用标准方法从1.0 mm OD（外径）硼硅酸盐玻璃毛细管移液器制备玻璃针。
   4. 使用细镊子将针尖折断至直径约 200 μm。确保针的圆柱轴不超过 2.5 厘米。
3. 校准注射泵以与 10 μL 注射器一起使用。输入 0.2 μL/min 的流速以输送 2.0 μL 的总体积。
4. 制备人诱导多能干细胞（hiPSC）悬液。
   1. 使用标准无菌处理技术在细胞培养 BSL-2（生物安全 2 级）罩中执行所有细胞处理。
   2. 根据为细胞类型定义的标准条件预先制备细胞培养物。
      注意：本演示中显示的实验使用了源自hiPSC的各种神经表型细胞。
   3. 使用细胞分离溶液或其他优选的酶或化学方法将细胞轻轻解离成单细胞悬液。
   对
   4. 悬浮液中的细胞进行计数，然后在 1.7 mL 翻盖试管中的最小细胞培养基（例如 DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium））中将悬浮液稀释至 5 x 10⁴ 个细胞/μL。
   在
   5. 移植时请遵守以下注意事项：
      在
      1. 手术期间将细胞悬浮在37°C。
      2. 仅在进行实质内注射之前立即加载注射器
         注意：如果细胞悬液侧放，重力会导致其沉降或粘附在注射器的侧面，从而导致注射的细胞数量不规则。
      如果在
      3. 一天内进行多个细胞移植程序，则每只小鼠分配~5 x 10⁵个细胞（10μL悬浮液）。
5. 进行立体定向移植手术
   将
   1. 小鼠置于麻醉诱导室中，该麻醉诱导室连接到带有压缩氧源的异氟醚蒸发器。用~0.7 L / min氧气的~3%异氟醚诱导麻醉。
   将
   2. 鼠标放在带有麻醉鼻锥的立体定位框架中。
      1. 用耳杆和咬合杆将头部固定到位，使头部朝向，使头骨额骨水平。在手术期间将麻醉保持在 1.5%-2% 异氟醚。
   3. 进行术前护理和无菌准备
      1. 使用棉签将含有抗生素的保湿眼药膏涂抹在眼睛上。
      2. 用无菌盐水灌洗切口部位以清洁该部位并松开缝线。用棉签轻轻涂抹 70% 乙醇，对切口部位进行消毒。
   4. 使用细镊子和眼科剪刀拆线。用充足的无菌生理盐水冲洗手术部位和颅骨切除术。
      1. 如果皮层表现出不合格的特征，例如过度突出、变色、血管化中断或出血，则应排除该动物。
   5. 加载细胞移植注射器
      将
      1. 细胞悬液从37°C培养箱移至细胞培养生物安全罩。轻轻旋转或敲击试管以确保细胞悬浮液均匀。
      2. 使用微型移液器通过柱塞端将 ~7.5 μL 细胞悬液加载到 Hamilton 注射器中。
         将
         1. 注射器保持在 ~120° 角，柱塞端朝下。插入柱塞，注意不要在悬架和柱塞尖端之间引入气泡。
      将
      3. 垫圈组件连接到移液器针头上，然后将针头连接到注射器上。
      4. 推动柱塞将细胞悬液移入移液器针头中。如果有悬浮液流出阻力，请用细镊子折断针尖以扩大直径。
   将
   6. 注射器连接到立体定位注射泵。推进柱塞以确保注射泵组件正常工作。
   将
   7. 针头移入注射坐标。
      将
      1. 针尖与 bregma 对齐。将 X 和 Y 坐标设置为 0。然后将针尖移过颅骨切除术，至前辫的外侧 2.0 毫米和后方 -1.0 毫米。将针尖接触硬脑膜表面，并将立体定位坐标设置为Z = 0。
      在将
      2. 针头引入大脑之前，推动柱塞以确保细胞悬液充分流动。
      将
      3. 针头引入大脑，深度为 Z = -1.4 mm。这些立体定位坐标将移植物放置在深层皮层的灰质-白质边界。
   8. 启动注射泵以注入细胞悬液。将实验室工作台定时器设置为 15 分钟并启动定时器。使用长工作距离显微镜监测细胞悬液流出。
      1. 注射时用无菌生理盐水冲洗手术部位以保持组织水合作用。
      2. 15分钟时，慢慢拔出移植针。用生理盐水冲洗手术部位，并用缝合线闭合切口。
   9. 进行术后护理
      1. 停止麻醉。通过以 10 mg/kg 剂量皮下注射到颈背中递送 CsA。将鼠标放入干净且预热的术后笼子中。
      在
      2. 饮用水中提供 1.0 mg/mL 的对乙酰氨基酚镇痛剂。
         注意：根据适当的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 标准作协议 （SOP） 并考虑实验结果变量提供镇痛
      。
      3. 提供一个湿润的食物回收笼，以帮助补液和恢复。
在
6. 整个小鼠生存期间，继续以10mg / kg的每日CsA注射。