立体定向移植神经细胞悬液至创伤性脑损伤小鼠

摘要

来源：Furmanski, O., et al. 小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源的神经细胞治疗性移植. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，将人源诱导性多能干细胞衍生的神经细胞通过立体定位法注射至创伤性脑损伤小鼠模型深部皮层的灰质-白质交界处。移植的细胞可整合入组织，促进损伤脑组织的功能恢复和神经环路修复。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 细胞悬液的立体定位移植

1. 在颅骨切除术后约24小时开始细胞移植操作。
2. 准备细胞移植设备和手术用品
   1. 用无菌生理盐水填充一支1 mL滑动式针筒，用于冲洗伤口。在针筒上安装25 G针头以控制冲洗过程。
   2. 用环孢素A（CsA）溶液填充另一支1 mL滑动式针筒，用于免疫抑制。在CsA针筒上安装25 G或更大规格的针头。根据需要在各次手术之间重新填充CsA针筒。
   3. 使用外径为1.0 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管，按照标准方法制备玻璃针头。
   4. 使用精细镊子将针尖折断至直径约为200 µm。确保针头圆柱部分长度不超过2.5 cm。
3. 校准针筒泵，使其适用于10 µL针筒。设定流速为0.2 µL/min，以输送总量为2.0 µL的液体。
4. 制备人诱导多能干细胞（hiPSC）悬液。
   1. 所有细胞操作均应在生物安全二级（BSL-2）细胞培养罩内，采用标准无菌操作技术进行。
   2. 根据细胞类型的特定标准条件提前准备细胞培养物。
      注意：本演示中所示实验使用了由hiPSCs衍生的多种神经表型细胞。
   3. 使用细胞解离溶液或其他合适的酶法或化学方法，将细胞轻柔地解离成单细胞悬液。
   4. 对悬液中的细胞进行计数，然后用最小量的细胞培养基（例如DMEM，即杜氏改良伊格尔培养基）稀释至5 × 10⁴ 个细胞/µL，并置于1.7 mL翻盖试管中。
   5. 进行移植时请注意以下事项：
      1. 在整个操作过程中，将细胞悬液保持在37 °C环境中。
      2. 仅在即将进行脑实质内注射前立即装填针筒。
         注意：若将细胞悬液平放，重力可能导致细胞沉降或附着于针筒壁，从而造成注射细胞数量不均。
      3. 若在一天内进行多次细胞移植操作，每只小鼠分配约5 × 10⁵ 个细胞（即10 µL悬液）。
5. 进行立体定位移植手术
   1. 将小鼠放入连接有异氟烷蒸发器及压缩氧气源的麻醉诱导室中。以约0.7 L/min的氧气流速和约3%的异氟烷浓度诱导麻醉。
   2. 将小鼠固定于立体定位仪中，并连接麻醉鼻罩。
      1. 使用耳杆和咬合杆固定头部，调整头部位置使颅骨额骨处于水平状态。在整个手术过程中维持1.5%–2%的异氟烷麻醉浓度。
   3. 进行术前护理和无菌准备
      1. 使用棉签将含抗生素的保湿眼膏涂抹于眼睛表面。
      2. 用无菌生理盐水冲洗切口部位，清洁该区域并松解缝线。随后用棉签轻轻涂抹70%乙醇以消毒切口部位。
   4. 使用精细镊子和眼科剪刀拆除缝线。用大量无菌生理盐水冲洗手术部位及颅骨切除区域。
      1. 若皮层出现不符合实验要求的特征，如严重脑疝、变色、血管结构破坏或出血，则应排除该动物。
   5. 装载细胞移植针筒
      1. 将细胞悬液从37 °C培养箱转移至细胞培养生物安全柜中。轻轻旋转或轻敲试管，确保细胞悬液均匀混合。
      2. 使用微量移液器从活塞端向Hamilton针筒中加载约7.5 µL细胞悬液。
         1. 将针筒以约120°角持握，活塞端朝下。插入活塞时注意避免在悬液与活塞尖端之间引入气泡。
      3. 将垫圈组件连接至移液针头，然后将针头安装到针筒上。
      4. 推动活塞，使细胞悬液进入移液针头。若悬液流出受阻，可用精细镊子轻折针尖以扩大其直径。
   6. 将针筒安装至立体定位针筒泵上。推进活塞以确认针筒泵组件工作正常。
   7. 将针头移至预定注射坐标位置。
      1. 将针尖对准前囟点，将X轴和Y轴坐标设为0。然后将针尖移至颅骨切除区域上方，定位至前囟外侧2.0 mm、后方-1.0 mm处。使针尖接触硬脑膜表面，并将立体定位Z坐标设为0。
      2. 推动活塞，确保在将针头插入脑组织前细胞悬液流动顺畅。
      3. 将针头插入脑组织至深度Z = -1.4 mm。该立体定位坐标可使移植物位于大脑深部皮层的灰质-白质交界处。
   8. 启动针筒泵以输注细胞悬液。将实验台计时器设定为15分钟并开始计时。使用长工作距离显微镜监测细胞悬液的流出情况。
      1. 在注射过程中用无菌生理盐水持续冲洗手术部位，以维持组织湿润。
      2. 15分钟后，缓慢撤出移植针头。用生理盐水冲洗手术部位，并用缝线关闭切口。
   9. 进行术后护理
      1. 停止麻醉。通过皮下注射方式在颈背部给予10 mg/kg剂量的CsA。将小鼠置于清洁且预热的术后饲养笼中。
      2. 在饮水中添加对乙酰氨基酚作为镇痛剂，浓度为1.0 mg/mL。
         注意：镇痛处理应遵循相应的机构动物护理与使用委员会（IACUC）标准操作程序（SOP），并结合实验结果变量综合考虑。
      3. 提供湿润饲料的恢复笼，以帮助小鼠再水化和恢复。
6. 在整个小鼠存活期间，持续每日皮下注射CsA，剂量为10 mg/kg。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 毫升注射器	Becton Dickinson (BD)	309659
1.7 毫升翻盖式试管	Denville	C2170
10 微升注射器	Hamilton	7635-01
25G 精密滑动注射针头	Becton Dickinson (BD)	305122
70% 乙醇			可选产品；因地区而异
对乙酰氨基酚口服混悬液	Tylenol (儿童用)		用水稀释至 1 mg/ml
麻醉气体蒸发器	Vetland	0521-11-22
动物操作布巾			可从百货商店购买
聚维酮碘（Betadine）	Purdue Products	NDC-67618-151-32
压缩氧气			可选产品；因地区而异
环孢素 A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
电工胶带	3M Corporation		可从百货商店购买
精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
镊子	Fine Science Tools	91106-12
玻璃毛细移液管，外径 1 mm，内径 0.58 mm	World Precision Instruments	1B100F-3
高速旋转微型电机套件	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
理想微型钻头套装（5 件装）	Cell Point Scientific	60-1000
CCI 用 Impact One 立体定位撞击器	Leica Biosystems	39463920
异氟烷	Baxter	NDC-10019-360-60
实验台计时器	Fisher Scientific	14-649-17
微量移液管拉制仪	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	任意型号均可满足需求
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-545-E
显微镜载玻片封片介质			可选产品
镜子			可从百货商店购买
持针器止血钳	Fine Science Tools	12002-12
眼科软膏	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
眼科弹簧剪刀	Fine Science Tools	15018-10
塑料盒			可从百货商店购买
塑料圆筒			可从百货商店购买
QSI 电动注射泵	Stoelting	53311
可拆卸针头压缩接头	Hamilton	55750-01
小型啮齿类动物立体定位仪	Stoelting	51925
小型剪刀	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
无菌酒精擦拭垫	Fisherbrand	06-669-62
无菌棉签/Kendall Q-tips	Tyco Healthcare	540500
无菌生理盐水	Hospira	NDC-0409-1966-07
秒表（2 个）	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold 显微镜载玻片	Fisherbrand	15-188-48
缝合线 — 5.0 丝线带弯针	Oasis	MV-682