慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

摘要

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了利用慢病毒转导神经前体细胞（NPCs），以靶向表观遗传修饰帕金森病关键蛋白α-突触核蛋白的方法。该方案通过甲基转移酶介导的DNA甲基化，降低SNCA基因的表达，可用于研究基因调控机制及潜在的治疗干预手段。

方案

1. 多巴胺能神经前体细胞的分化

1. 解冻中脑多巴胺能神经前体细胞（MD NPCs）
   1. 准备经BMM（基础基质膜）包被的培养板，并将完全型N2B27培养基预热。取10 mL预热的DMEM/F12培养基加入15 mL锥形管中。将冻存管置于37 °C金属浴中解冻2分钟。
      1. 将细胞从冻存管转移至含有DMEM/F12的锥形管中，于300 x g 离心5分钟。
      2. 吸除上清液，用2 mL N2B27培养基重悬细胞，将细胞悬液加入BMM包被培养板的一个孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。

2. MD-NPCs 的转导及甲基化变化分析

1. MD NPCs 的转导
   1. 当 MD NPCs 达到 70% 汇合度时，用慢病毒载体（LV）-引导 RNA/失活 Cas9-DNMT3A（DNA 甲基转移酶 3A）在感染复数（MOI）= 2 的条件下进行转导。转导后 16 小时更换 N2B27 培养基。
   2. 转导后 48 小时，加入含 5 µg/mL 嘌呤霉素的 N2B27 培养基。在含嘌呤霉素的 N2B27 培养基中培养细胞 3 周，以获得稳定的 MD NPC 细胞系。细胞可用于后续实验（DNA、RNA、蛋白质分析、表型鉴定、冻存和传代）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430791
6 孔板	Corning	3516
Allegra 25R 台式离心机	Beckman Coulter	369434
倒置荧光显微镜	Leica	DM IRB2
细胞培养试剂
抗生素-抗真菌素溶液，100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 补充剂（50X），不含维生素 A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC 验证级基质	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 补充剂（100X）	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049