子宫内小鼠病毒转导

摘要

来源： Lutz, D., et al. 在子宫内转导发育中小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了通过子宫内注射在小鼠胚胎中进行病毒转导的方法。将怀孕小鼠进行手术准备，沿中线做切口以暴露子宫角。将含有目的基因的病毒与示踪染料的混合物注射到子宫囊内特定位置的胚胎中。随后将子宫角复位并缝合切口。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 子宫内转导

1. 制备编码目标序列的1型腺相关病毒（AAV1）（4 x 10¹¹ 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中含病毒颗粒/µL的AAV1，加入0.1 mg/µL Fast Green，将AAV1-Fast Green混合物置于37 °C保存。
2. 使用拉针仪制备所需形状的细毛细管尖端（长度为 8 mm，外径为 80 µm，内径为 50 µm）（参数设置：压力 = 500，加热 = 700，拉力 = 0，速度 = 80，时间 = 200，参见 材料表）。折断毛细管尖端，使其长度为4-5 mm。
3. 组装一根吸管（44 cm × 0.7 cm），连接毛细管尖端，并将15 µL AAV1-Fast-Green混合物吸入毛细管中。
4. 在整个实验过程中，保持实验动物的生理体温恒定在 37 °C。
5. 将一只妊娠第14.5天的C57Bl/6小鼠放入预孵育室，用4%异氟烷气体（体积空气流速为0.6–0.8 L/min）麻醉小鼠。
6. 皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg 体重）。
7. 将麻醉后的小鼠置于预热的手术板（37 °C）上。
8. 用润滑剂覆盖眼睛。
9. 将小鼠置于手术板上，连接麻醉面罩（使用体积流速为 0.6–0.8 L/min 的 1.5% 异氟烷气体），并剃除腹部皮肤区域的毛发。用 75% 乙醇擦拭 3 次，再用聚维酮碘溶液擦拭剃除区域。
   注意持续监测麻醉小鼠的呼吸行为。根据小鼠的吸气-呼气模式调整异氟烷气体的浓度。
10. 通过捏压小鼠后肢脚趾的趾骨来检查足底反射是否消失。
11. 使用弯齿虹膜镊（10 cm）夹住皮肤，沿腹白线用直的碳化钨手术剪（10 cm）剪开皮肤，打开腹腔；然后用直的杜蒙镊（12 cm，0.2 mm × 0.12 mm）夹住腹膜壁，沿白线用直的瓦纳剪（8 cm）剪开腹膜壁。
12. 将一片带孔的石蜡膜置于腹部开口处，并使用微型蚊式止血钳（12.5 cm，弯曲型）在两端固定薄膜。
13. 使用勺状器械暴露子宫角，以避免损伤子宫角内的胚胎。在子宫角上滴加数滴PBS（37 °C），观察子宫囊内胚胎是否存在损伤或畸形。
14. 记录胚胎在子宫角中的顺序和位置。小心地在子宫囊内转动胚胎，直至达到所需的注射位置。
15. 在体视显微镜下观察注射部位（如脑室）及染料渗透情况，注入1-2 µL AAV1-Fast-Green混合液。
16. 记录注射后的胚胎，并将含有注射胚胎的子宫角放回腹腔。
17. 向腹腔内滴加数滴 PBS（37 °C）。使用哈尔斯特德蚊式止血钳（12.5 cm，弯曲型），以聚酰胺 6-0 缝线缝合腹膜壁，以聚酰胺 3-0 缝线缝合皮肤，关闭腹腔。或者，也可采用单纯间断缝合方式，或使用不锈钢缝线/缝钉关闭腹腔和皮肤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26G×1英寸针头	Henke-Sass, Wolf GmbH
410型麻醉泵用空气泵单元	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
腺相关病毒血清型1（AAV1）	UKE（病毒核心设施）	-	有关AAV1的参考文献和靶向区域，请参见：https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ 以及：Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. 重组腺相关病毒载体（假型化为血清型1、2和5的病毒衣壳）在递送至中枢神经系统不同区域后表现出不同的转导效率和细胞趋向性。Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. 自互补型重组腺相关病毒（scAAV）载体可在不依赖DNA合成的情况下实现高效转导。McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
空气泵	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
吸液调节组件	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
小鼠用阳极氧化铝呼吸面罩	Biomedical Instruments (Univentor)	-
布托啡诺	Temgesic	安瓿	镇痛药
毛细管	Science-Products	GB100TF-10	带填充丝
杜蒙特镊子（#3，12 cm，直头，0.2 × 0.12 mm）	FST	11203-23
电动剃须刀	Philips	-
爱惜康缝线（Ethilon，6-0 和 3-0）	Ethicon	-	聚酰胺
眼用润滑剂	Bepanthene	-
快绿染料	Sigma-Aldrich	F7252	用于可视化注射液体
气体通路切换器 4/2 接口	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
哈尔斯特德蚊式止血钳（12.5 cm，直头）	FST	13011-12
带水平滑动盖的小鼠诱导箱。内部尺寸：长×宽×高：155×115×130 mm。壁厚：6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
虹膜镊（10 cm，弯头，带齿）	FST	14007-14
虹膜剪（11 cm，直头，碳化钨）	FST	14501-14
异氟烷操作台，电加热，小型。外部尺寸：257×110×18 mm。加热区域：190×90 mm。逸出呼吸面罩的异氟烷向下排放，符合相关法规要求	Biomedical Instruments (Univentor)	-
异氟烷（Attane）	JD medical		吸入麻醉剂
基础型光学显微镜 DM E	Leica	-	配备4×（数值孔径0.1 ∞/-）、10×（数值孔径0.22 ∞/0.17）、40×（数值孔径0.65 ∞/0.17）、100×（数值孔径1.25 ∞/0.17）物镜
微电极拉制仪	Science-Products	P-97
蚊式止血钳（12.5 cm，弯头）	FST	13010-12
热拉制仪 P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 管路材料，用于连接所有部件。外径：6 mm，内径：4 mm，壁厚：1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)
万纳斯剪（8 cm，直头）	FST	15009-08