向卒中后小鼠模型立体定向注射水凝胶

摘要

来源：Wilson, K.L., et al. 脑卒中后向脑内注射水凝胶生物材料支架。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了将水凝胶立体定位注射至卒中后小鼠脑卒中核心区域的过程，重点阐述了水凝胶在模拟细胞外基质、促进细胞浸润和支持血管生成方面的作用，凸显其在卒中恢复中的神经治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注射水凝胶或其他生物材料

1. 在用户定义的时间点进行生物材料注射。本实验中，注射在卒中后5至7天内进行。注射2 - 6 µL水凝胶。
   1. 打开加热垫，以维持小鼠在麻醉期间的体温（37 °C）。
   2. 准备已灭菌的剪刀、镊子、棉球、兽用眼膏、手术胶或缝合材料、无菌酒精和碘伏擦拭片。准备配备无菌钻头的骨钻，以及带有金属30 G针头的25 µL玻璃哈密尔顿注射器。
   3. 将珠式灭菌器加热至160 °C，以便在不同小鼠之间对器械进行灭菌。
   4. 将注射泵连接至立体定位仪。设定流速为1 µL/min，并设定注射体积为4 µL。
   5. 为术后小鼠准备一个清洁的笼子。
2. 将小鼠放入诱导室，使用4%异氟烷浓度进行麻醉，直至其自发运动停止且呼吸变为缓慢而稳定的节律。
   1. 待小鼠入睡后，将其转移并固定于立体定位仪上，维持1.5%异氟烷浓度。
   2. 在双眼涂抹兽用眼膏。
   3. 剃除小鼠头部可能再生的毛发，并使用酒精擦拭片随后使用碘伏擦拭片对术区进行无菌处理，重复三次。
      注意：如有必要，最后可额外使用一次酒精擦拭片清除所有残留碘伏，因其可能引起皮肤刺激，导致小鼠术后抓挠颅骨。
3. 使用小剪刀和/或镊子重新切开脑部上方的皮肤。用浸有无菌生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）的棉球清理颅骨上的任何碎屑。此时可见一个白色至黄色的环形区域（即卒中区域，图1B）以及钻孔留下的孔洞。若无法观察到坏死组织，则可能未发生卒中；若钻孔未位于卒中区域正上方，应重新钻孔以校准位置。
4. 将注射泵对准小鼠并锁定于90°角。在回吸材料前，先用无菌生理盐水或PBS溶液清洗注射器。
   1. 清洗完毕后，拆卸玻璃注射器使其脱离针头。使用25 µL正向置换移液器将10 µL水凝胶（或其他含或不含细胞的生物材料）从后端装入注射器。
   2. 使用注射器推杆将凝胶完全推至注射器前端。然后重新组装注射器并继续推动，直至可见凝胶从针头端渗出。
5. 将注射器安装到注射泵上。可能需要调整泵的后部以适配注射器。将流速调节至30 µL/min，根据所需移动方向选择回吸或注射模式，然后按下开始。当泵的后部到达正确位置时，按下停止。
   1. 旋紧泵的后部以固定注射器。若此前进行了调整，请确保将流速重新设定为1 µL/min，并处于注射模式。
6. 移动注射泵的X和Y方向，使其对准钻孔位置。沿Z方向向下移动泵体，直至注射器针头接触孔口顶部。
7. 在数字显示控制台上重置Z轴坐标。然后将注射器沿Z方向再下移0.750 mm。若注射器发生弯曲或遇到阻力，说明颅骨可能已愈合或未完全钻透，需重新钻孔。
8. 在注射泵控制台上按下开始，以1 µL/min的速率注射4 - 6 µL水凝胶。
9. 当泵停止注射后，设置5分钟计时器，以允许凝胶开始交联。
10. 5分钟后，通过旋转Z轴旋钮缓慢上提注射器。观察是否有材料被意外抽出或从孔中泄漏。当针头远离颅骨足够距离后，解锁注射泵并将其移开。
11. 使用镊子、手术胶或缝线闭合头部皮肤。将小鼠放入清洁笼中并观察其恢复情况。小鼠从麻醉中恢复通常需要约5 – 10分钟。

结果

图1：前囟的示意图及脑卒中定位。（A）顶叶在顶部交汇形成前囟，激光定位点位于前囟左侧2.0 mm处。（B）脑卒中发生5天后可见脑卒中的视觉确认图像及颅骨钻孔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 µL Hamilton 注射器 702RN，无针头	Fisher Scientific	14824663	用于注射生物材料的注射器
25 µL 正向置换移液器	Gilson	M-25
可调式载物台平台	Kopf Instruments	901
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratory	664	8–12 周龄
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	长 3 英寸，直径 6 mm，4 件装——用于将激光器固定至立体定位仪
棉签	VWR	89031-288
CP 25 移液器吸头	Gilson	F148012
加热板	Kopf Instruments	HP-4M
IMPAC 6 综合多患者麻醉中心	VetEquip	901808
珠宝商镊子 #5	GFS chemicals	46085
Miltex Adson 组织镊，解剖级	Integra Miltex	V96-118
微型泵可变流速泵	Thomas Scientific	70730-064	用于灌注的泵
小鼠气体麻醉头固定器	Kopf Instruments	923-B
Nanojet 控制箱	Chemyx	10050
Nanojet 泵接头	Chemyx	10051	连接至立体定位装置以注射生物材料
针头 RN 30G PT STY 3，0.5 英寸	Fisher Scientific	NC9459562
非穿刺式耳杆 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet 软膏	Dr. Foster Smith	9N-76855
小鼠直肠探头	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 胰岛素注射器，带 1/2 单位刻度，0.5 mL	VWR	10002-726	用于注射玫瑰红染料
StainTray 载玻片染色系统	Simport Scientific	M920-2	用于载玻片染色
立体定位仪	Kopf Instruments	940	小型动物立体定位仪
学生用 Adson 镊子 - 1×2 齿	Fine Science Tools	91127-12
学生用精细镊子 - 直头/宽柄	Fine Science Tools	91113-10
温度控制器	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT 包埋剂	VWR	25608-930
Vetbond 组织粘合剂 3 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931