构建大鼠神经损伤模型中的复合再生性外周神经接口

摘要

来源： Svientek, S. R., 等．成年大鼠复合再生性外周神经接口（C-RPNI）的制备． J. Vis. Exp. （2020）。

本视频展示了在周围神经损伤大鼠模型中构建复合再生性周围神经接口（C-RPNI）的手术方法。该操作包括将横断的腓神经连接至肌肉移植物，并覆盖真皮皮肤移植物以促进神经再生。随着时间推移，运动和感觉神经元在移植物内重新建立连接，从而形成功能性的神经肌肉和感觉结构。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意：在进行皮肤和肌肉捐献操作前，供体大鼠可自由进食和饮水。安乐死操作在深度麻醉下进行，随后通过心内注射氯化钾，并辅以双侧气胸作为二次确认方法。理论上，本实验可使用任何品系的大鼠；然而，本实验室在2至4月龄、体重约200–250 g的雄性和雌性Fischer F344大鼠中获得了稳定一致的结果。供体大鼠必须与实验大鼠为同基因型。

1. 皮肤移植物的制备

1. 在诱导室中使用5%异氟烷氧气混合气体（流速0.8–1 L/min）对供体大鼠进行麻醉。大鼠麻醉后，将其从诱导室中取出，置于复吸入式鼻罩中，并将异氟烷浓度下调至2–2.5%以维持麻醉状态。
2. 在肩胛骨之间皮下注射0.2 mL无菌生理盐水配制的卡洛芬（50 mg/mL）溶液0.02–0.03 mL，用于镇痛。
3. 双眼涂抹人工泪液软膏，以预防角膜溃疡。
4. 使用电推剪剃除整个后肢下部、踝关节区域以及足部侧面的毛发。
5. 用酒精清洁选定的后肢及足底表面，随后使用碘伏溶液进行清洁，最后再用酒精彻底清洁以去除残留的碘伏。
6. 使用手持微型电机高速钻头配合可拆卸的圆形细粒抛光石（4000 rpm），打磨足底表面以去除表皮。打磨过程中滴加生理盐水，防止灼伤皮肤。真皮层暴露后呈光泽状，并可见点状出血。
7. 在下肢应用止血带以减缓血流。
8. 用15号手术刀锐性切除足底皮肤，并将其置于生理盐水浸湿的纱布中以防止干燥。此步骤中会连带去除部分肌腱和结缔组织，后续将予以清除。
9. 用纱布包裹出血的足部以减缓出血。若制备两个构造物，则重复步骤1.5–1.9。
10. 在显微镜下（20倍放大），使用显微剪刀从皮片深层去除肌腱和结缔组织。注意避免在皮片上造成穿孔。去薄后的真皮移植物应略呈半透明，仅含真皮层，大小约为0.5 cm × 1.0 cm。
11. 置于生理盐水浸湿的纱布中，直至准备进行C-RPNI构建。移植物应在采集后2小时内使用。

2. 肌肉移植物的制备

1. 用15号手术刀从踝关节上方至膝关节下方沿后肢前侧做一纵行切口。分离皮下组织，暴露其下方的肌肉组织。
2. 在切口的远端，暴露下肢肌肉的肌腱止点。胫骨前肌（TA）通常是该区域最大且位置最靠前的肌肉，其深面偏后方为趾长伸肌（EDL）。将EDL远端肌腱与其他邻近肌腱分离，注意在此步骤中避免切开其止点。
3. 通过将镊子的两个尖端插入肌腱下方，并张开镊子施加向上的压力，使肌腱移动，从而确保正确肌腱的分离。操作该肌腱时应引起所有脚趾同时伸展。
4. 使用锐性虹膜剪进行远端肌腱切断术，并用肌腱分离器（或其他钝头剪刀）钝性分离肌肉与周围组织，向近端推进以寻找肌腱起源处。
5. 当观察到近端肌腱后，再次使用锐性虹膜剪刀进行肌腱切断术。将肌肉移植物置于生理盐水浸湿的纱布中，以防止干燥。
6. 当从供体大鼠获取所有所需移植物后，主要通过心内注射氯化钾（1–2 mEq K+/kg）实施安乐死，随后使用#15刀片进行双侧穿刺性气胸作为辅助安乐死措施。

腓总神经的分离与制备

1. 根据步骤1.1-1.3中所述方案对实验大鼠进行麻醉和镇痛处理。
2. 剃除所需的大腿区域，然后用酒精、聚维酮碘擦拭，最后再用酒精擦拭以去除聚维酮碘残留。
3. 将动物从手术准备台转移至手术显微镜台，放置在带有体温探头的加热垫上以维持体温。维持异氟烷浓度为2-2.5%，氧气流速为0.8-1 L/min。
4. 从坐骨切迹远端开始，沿膝关节下部做切口标记。该标记应位于股骨下方，并向外侧倾斜避开股骨。使用#15刀片沿标记切开，穿透下方的股二头肌筋膜。
5. 使用止血钳或钝头显微剪刀小心地分离股二头肌，直至暴露股二头肌下方的间隙。
   注意： 坐骨神经的走向大致与最初的切口方向相同。该神经通常分为三个分支，其中腓肠神经位于后方，腓总神经和胫神经则分别沿膝关节浅层和深层走行。
6. 在识别出腓总神经（CP神经）后，使用一对显微精细镊子和显微剪刀，小心地将CP神经从其他坐骨神经分支中分离，并远端去除残留的结缔组织。
7. 在神经跨越膝关节表面的位置，使用显微剪刀迅速将其横断。
   注意： 使用锋利的剪刀在此步骤中极为重要，因为对神经造成明显创伤可能会增加神经瘤形成的风险。
8. 仔细分离CP神经上残留的结缔组织，并向近端游离神经至长约2 cm。

4. C-RPNI 结构建备

1. 从生理盐水浸湿的纱布上取下肌肉移植物，去除所有中央的腱性组织以及中央一小段肌外膜，保留两端的腱性结构完整。
2. 使用8-0尼龙缝线，将CP神经横断端的神经外膜与肌肉移植物上无肌外膜区域的两侧分别以两个间断缝合固定。
3. 在近端和远端各使用一根6-0尼龙间断缝线，将肌肉移植物固定于股骨骨膜上，确保神经-肌肉连接处背离股骨。
   注意：固定肌肉时应使其处于正常、放松的长度。避免显著拉伸肌肉或在固定时留下过多松弛。
4. 在肌肉移植物肌外膜的下缘中央位置放置一根8-0尼龙缝线，将其固定于CP神经的神经外膜，使神经在肌肉移植物内形成一定松弛度，以帮助缓解日后活动时可能产生的张力。
5. 从生理盐水浸湿的纱布上取下皮肤移植物，并将其覆盖在肌肉移植物上，完全包覆神经及大部分肌肉组织。确保真皮层深部边缘贴附于肌肉表面。修剪掉超出肌肉边缘的多余真皮组织。
6. 使用8-0尼龙间断缝线将皮肤移植物周向地固定于肌肉移植物上。通常根据构建物大小使用总共4至8根缝线。
7. 使用5-0铬制肠线连续缝合闭合股二头肌筋膜覆盖于构建物之上。
8. 使用4-0铬制肠线连续缝合关闭表层皮肤。
9. 用酒精棉片擦拭手术区域，并涂抹抗生素软膏。
10. 停止吸入麻醉，让大鼠在与笼内同伴隔离的情况下恢复，并提供独立的食物和水源。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#15 手术刀	Aspen Surgical, Inc	Ref 371115	背脊碳钢手术刀片（#15）
4-0 肠线缝合线	Ethicon	SKU# 1654G	P-3 反向切割针
5-0 肠线缝合线	Ethicon	SKU# 687G	P-3 反向切割针
6-0 Ethilon 缝合线	Ethicon	SKU# 697G	P-1 反向切割针（尼龙缝合线）
8-0 单丝缝合线	AROSurgical	T06A08N14-13	带螺纹锥形针的黑色聚酰胺单丝缝合线
实验用大鼠	Envigo	F344-NH-sd	大鼠为 Fischer F344 品系
Fluriso（异氟烷）	VetOne	13985-528-40	吸入性麻醉剂
带砂轮的高速微型电机钻	Master Mechanic	Model 151369	手持式旋转工具；套件包含多种细粒度砂轮
氧气	Cryogenic Gases	UN1072	标准医用级氧气罐
氯化钾	APP Pharmaceuticals	63323-965-20	注射用，2 mEq/mL
聚维酮碘 USP	MediChoice	65517-0009-1	10% 外用溶液，一瓶可用于多次手术准备
Puralube Vet 眼科软膏	Dechra	17033-211-38	术中角膜保护软膏
Rimadyl（卡洛芬）	Zoetis, Inc.	NADA# 141-199	注射用，50 mg/mL
体视显微镜	Leica	Model M60	用户可根据需要调节放大倍数
外科手术器械	Fine Science Tools	Various	用户可根据个人偏好或实验室现有条件选择器械
三联抗生素软膏	MediChoice	39892-0830-2	软膏为无菌一次性包装
VaporStick 3	Surgivet	V7015	麻醉装置，可容纳异氟烷和氧气罐
Webcol 酒精消毒片	Coviden	Ref 6818	酒精消毒擦拭片；每次消毒使用新的擦拭片