神经损伤大鼠模型复合再生周围神经界面的构建

Abstract

资料来源： Svientek， SR 等人。成年大鼠复合再生周围神经界面（C-RPNI）的制备。 J. Vis. Exp.（2020）。

该视频演示了在周围神经损伤大鼠模型中复合再生周围神经界面 （C-RPNI） 的手术构建。该过程包括将横切的腓神经连接到肌肉移植物上，并用真皮皮肤移植物覆盖以促进神经再生。随着时间的推移，运动和感觉神经元在移植物内重新建立连接，从而能够形成功能性神经肌肉和感觉结构。

Protocol

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

注意：在皮肤和肌肉捐献程序之前，允许供体大鼠免费获得食物和水。安乐死在深度麻醉下进行，然后心内注射氯化钾，并采用双侧气胸的二次方法。理论上，任何品系的大鼠都可以用于该实验;然而，我们的实验室在两到四个月大的雄性和雌性Fischer F344大鼠（~200-250 g）中都取得了一致的结果。供体大鼠必须与实验大鼠同基因。

1.真皮移植物的制备

：

1. 在诱导室中使用5%异氟醚在氧气中的溶液以0.8-1 L / min的速度麻醉供体大鼠。大鼠被麻醉后，从诱导室中取出并放在再呼吸鼻锥上，将异氟醚降低至2-2.5%以维持麻醉。
将
2. 0.02-0.03 mL 卡洛芬 （50 mg/mL） 溶液溶于 0.2 mL 无菌盐水中，皮下注射在肩胛骨之间进行镇痛。
在
3. 双眼上涂抹人工泪液软膏，以防止角膜溃疡。
4. 使用理发器剃掉整个下后肢、脚踝区域和爪子两侧。
5. 用酒精清洁选定的后肢和爪子的足底表面，然后用碘聚维酮溶液清洁，最后用酒精进行最后清洁以去除残留的碘聚维酮。
6. 使用手持式微型电机高速钻头和可拆卸的圆形细砂抛光石（4000 rpm），在爪子的足底表面进行毛刺以去除表皮。毛刺时，滴上盐水，以免烫伤皮肤。下面的真皮将具有闪亮的外观，并伴有精确出血。
将
7. 止血带敷在下肢以减缓血流。
8. 用 #15 手术刀锐利去除足底皮肤，并将其放入蘸有盐水的纱布中以防止干燥。在此步骤中，一些肌腱和结缔组织将与皮肤一起固有地去除，稍后将被去除。
在
9. 流血的脚上敷上纱布以减缓出血。如果执行两个构造，请重复步骤 1.5-1.9。
10. 在显微镜下（20 倍放大倍率），使用显微剪刀从皮肤移植物的深层去除肌腱和结缔组织。注意不要在移植物上打孔。变薄的真皮移植物应略微不透明，仅包含真皮，尺寸约为 0.5 厘米 x 1.0 厘米。
11. 放入盐水润湿的纱布中，直到准备好制造 C-RPNI 构建体。移植物应在收获后 2 小时内使用。

2. 肌肉移植物的准备

用

1. #15 手术刀沿着下后肢的前部从脚踝上方到膝盖下方做一个纵向切口。解剖皮下组织以暴露下面的肌肉组织。
2. 在切口的远端，露出下肢肌肉组织的肌腱插入处。胫骨前肌 （TA） 通常是最大和最靠前的肌肉，该肌肉的正下方和后方是趾长伸肌 （EDL）。将远端 EDL 肌腱与该区域的其他肌腱隔离，注意此时不要切开其插入处。
通过
3. 将镊子的两个尖齿插入肌腱下方并通过打开镊子来施加向上压力以引起肌腱偏移，确保隔离正确的肌腱。纵这条肌腱应该使所有脚趾同时伸展。
4. 用锋利的虹膜剪刀进行远端肌腱切开术，并用肌腱切开术（或其他钝头剪刀）钝地将肌肉与周围组织分离，在近端工作以找到肌腱起源。
5. 一旦看到近端肌腱，再次使用锋利的虹膜剪刀进行肌腱切开术。将肌肉移植物放入盐水润湿的纱布中以防止干燥。
6. 一旦从供体大鼠身上取出所有所需的移植物，主要通过心内注射KCl（1-2 mEq K + / kg）实施安乐死，然后使用#15刀片进行双侧穿刺气胸的二次安乐死。

3.腓总神经分离和制备

根据

1. 步骤1.1-1.3中概述的方案对实验大鼠进行麻醉和镇痛。
剃
2. 掉所需的大腿毛，用酒精、甜菜碱清洁，最后用酒精去除甜菜碱的痕迹。
3. 将动物从手术准备台移至手术显微镜台上，并将其放在带有温度探头的加热垫上以维持体温。将异氟醚保持在 2-2.5%，氧气保持在 0.8-1 L/min。
4. 标记切口，从远端延伸到坐骨切痕到膝盖的下部。该标记应低于股骨，并且倾斜于股骨。用 #15 刀片切开切口，切开下面的股二头肌筋膜。
5. 用止血剂或钝头显微剪刀小心地解剖股二头肌，到达股二头肌下方的空间。
   注意：坐骨神经的行进方向与最初的切口大致相同。共有三个分支，通常腓肠神经后部，腓总神经和胫骨总神经分别向浅表和深部延伸至膝盖。
在
6. 识别腓总神经 （CP） 后，使用一对微细头镊子和微剪刀，小心地将 CP 神经与其他坐骨神经分支隔离开来，并去除远端任何残留的结缔组织。
7. 在神经穿过膝盖表面的点，用显微剪刀锐利地横切神经。
   注意：在此步骤中使用锋利的剪刀非常重要，因为对神经造成重大创伤可能会增加神经瘤形成的风险。
8. 小心地从 CP 神经中释放任何剩余的结缔组织，并在近端工作以将神经释放至约 2 厘米的长度。

4. C-RPNI 构建体制作

1. 从盐水润湿的纱布中取出肌肉移植物，并去除所有中央肌腱组织以及肌外膜的一小块中央段。保持肌腱末端完好无损。
2. 使用 8-0尼龙缝合线，将 CP 神经横切端的神经外膜固定到没有肌外膜的肌肉移植物区域，在神经两侧缝有两针断续缝。
3. 用单针 6-0 尼龙间断缝线将肌肉移植物固定到股骨骨膜上，在近端和远端，神经-肌肉交界处背对股骨。
   注意：固定肌肉，使其处于正常、放松的长度。固定时尽量不要明显拉伸肌肉或留下太多松弛。
4. 放置一个 8-0在肌肉移植物肌外膜的下中央边缘进行尼龙缝合，将其固定到 CP 神经神经外膜上，从而使肌肉移植物内的神经松弛，并有助于缓解未来在以后的行走中可能暴露的任何张力。
从
5. 盐水润湿的纱布上取下皮肤移植物，并将其排列在肌肉移植物上，以完全覆盖神经和大部分肌肉。确保真皮的深缘靠在肌肉上。修剪任何超出肌肉边界的真皮。
6. 使用 8-0 将皮肤移植物沿圆周固定到肌肉移植物上尼龙中断缝合线。通常，根据结构的大小，总共使用 4-8 根缝合线。
7. 用 5-0 铬缝合线以跑步方式将股二头肌筋膜闭合在结构上。
以
8. 跑步方式用 4-0 铬缝合线闭合上覆的皮肤。
9. 用酒精垫擦拭手术区域并涂抹抗生素软膏。
10. 停止吸入麻醉，让大鼠在与笼子伴侣分开的食物和水源中恢复。

Materials