基于光降解水凝胶的微孔阵列细菌菌落分离

摘要

来源：Fattahi, N., et al．用于细菌筛选、选择与分离的光降解水凝胶界面．J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用光降解水凝胶在硅基微孔阵列中分离细菌克隆的方法。首先将细菌细胞加载至微孔中，包埋于交联水凝胶内，并培养形成独立的菌落。经紫外光照射后，水凝胶发生靶向降解，从而实现单个菌落的选择性提取。

方案

1. 细菌菌株与培养方案

1. 在添加适当培养基的琼脂平板上划线接种细菌菌落。本报告中，Bacillus subtilis（菌株1A1135，Bacillus Genetic Stock Center）在ATGN（0.079 M KH₂PO₄、0.015 M (NH₄)₂SO₄、0.6 mM MgSO₄·7H₂O、0.06 mM CaCl₂·2H₂O、0.0071 mM MnSO₄·H₂O、0.125 M FeSO_4·7H₂O、28 mM 葡萄糖，pH：7 ± 0.2，15 g/L 琼脂）琼脂平板上培养，并添加100 µg/mL 链霉素；Escherichia coli（菌株25922，ATCC）则在添加100 µg/mL 氨苄青霉素的ATGN琼脂平板上培养。
   注意： 此前关于这些材料的水凝胶包封与释放的研究使用的是A. tumefaciens C58细胞
2. 从ATGN琼脂平板上挑取目标菌落，开始过夜培养。对于本实验所用的E. coli和B. subtilis菌株，在ATGN液体培养基中于37 °C、215 rpm振荡条件下培养24小时。将菌种保存于含50%甘油的冻存管中，置于-80 °C冰箱中以备后续使用。
3. 使用无菌接种环从甘油保存菌种中挑取两种菌株的菌落，接种于ATGN液体培养基中，在37 °C、215 rpm条件下振荡培养24小时。

2. 准备水凝胶形成所需的材料

1. 光降解性聚乙二醇-邻硝基苄基二丙烯酸酯（PEG-o-NB-diacrylate）的合成
   注意： PEG-o-NB-diacrylate 的实验室合成方法已有详细描述并被先前报道。此外，由于该合成属于常规操作，也可委托专业化学合成机构进行。
2. 交联缓冲液
   1. 根据所选细菌菌株培养基的配方，配制含两倍营养成分的培养基。向培养基中加入磷酸盐，例如 NaH₂PO₄，使其终浓度为 100 mM。然后使用 5 M NaOH（水溶液）将 pH 值调节至 8。
   2. 将缓冲液溶液灭菌，并于 -20 °C 保存备用。
      注意：请勿添加培养基中可能含有的过渡金属，因为这些金属会催化巯基氧化为二硫键。
3. PEG-o-NB-diacrylate 溶液
   1. 每取 1 mg 分装的 PEG-o-NB-diacrylate（分子量 3,400 Da）粉末，加入 3.08 µL 超纯水，以获得 49 mM 的 PEG-o-NB-diacrylate 浓度（丙烯酸酯浓度为 98 mM）。
   2. 涡旋震荡溶液至充分混匀，并将该溶液于 -20 °C 保存备用。
4. 四臂 PEG-巯基溶液
   1. 配制四臂 PEG-巯基（分子量 10,000 Da）时，每 1 mg 粉末加入 4 µL 超纯水，以获得 20 mM 的浓度（巯基浓度为 80 mM）。
   2. 涡旋震荡该溶液至充分混匀，并将该溶液于 -20 °C 保存备用。

5. 硅微孔阵列的制备

1. 聚对二甲苯涂层：采用先前研究文章中描述的标准方案，对硅片进行聚对二甲苯涂层处理。
2. 微加工：遵循文献中所述的方案，设计并制备微孔阵列（图1）。​
   注意：采用标准的光刻技术在涂覆聚对二甲苯的硅片上制备微孔阵列。

7. 微孔阵列表面水凝胶的形成

1. 在微孔阵列中接种细菌
   注意：将700 µL浓度为0.1 OD₆₀₀ （在600 nm波长下的光密度）的细胞悬液接种至微孔阵列基底上，并采用聚对二甲苯剥离法去除背景区域的细胞。
2. 通过将5.6 µL PEG-o-NB-二丙烯酸酯与12.5 µL pH 8的磷酸盐缓冲液ATGN混合，并加入6.9 µL四臂PEG硫醇溶液，配制水凝胶前体溶液。
3. 用移液器吸取12.5 µL前体溶液滴加至惰性全氟烷基化玻璃载片上，并在已接种细胞的微孔阵列基底两侧相对位置放置两个38 µm钢制间隔片（见材料表）。
4. 将带有前体溶液液滴的全氟烷基化玻璃载片翻转，使液滴位于微孔基底中央，随后在室温（RT）下孵育25分钟以形成水凝胶。
5. 轻柔地将玻璃载片从微孔基底上移除，水凝胶膜应保留在微孔基底上。

结果

图1：微孔阵列的设计与制备。（A）采用标准的微加工技术在硅晶圆上制备微孔阵列。（B）每个基底包含7 × 7排列的微孔，孔径为10 µm，深度为20 µm，间距为30 µm。（C）每个阵列包含225个微孔。该图经Barua

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸铵	Fisher Chemical	A702-500	分析纯级颗粒
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
明场直立显微镜	Olympus Corporation	BX51
无水氯化钙	Fisher Chemical	C614-500	干燥器用颗粒，4-20目
DOWSIL 184 硅橡胶基础剂	Dow Silicones Corporation		储存温度：-30–60 °C
DOWSIL 184 硅橡胶固化剂	Dow Silicones Corporation		储存温度：< 32 °C
EPOCH2 微孔板分光光度计	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
无水乙醇	Fisher Chemical	459844
Fisherfinest 优质显微镜载玻片（普通型）	Fisher Scientific	12-544-4
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	216763-500ML	含抑制剂，H2O 中含量为 30 wt%
异丙醇	Sigma-Aldrich	190764
七水合硫酸镁	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
甲醇	Sigma-Aldrich	179337-4L	分析纯试剂，> 99.8%
压缩氮气	Matheson	UN1066
季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯（4臂-PEG）	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
磷酸盐缓冲液 (PBS)，10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	储存温度：15 °C–30 °C
优质显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-4	25 × 75 × 1 mm
氯化钠	Sigma Life Science	S5886-500G	生物试剂，适用于细胞培养
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra，> 98%，颗粒状（无水）
二水合磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra，分子生物学用，> 99.0% (T)
不锈钢测厚规	Precision Brand Products	77739