革兰氏阴性菌内膜与外膜组分的分离

摘要

来源：Cian, M. B. 等.，将革兰氏阴性细菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分，并针对Acinetobacter baumannii进行技术优化。J. Vis. Exp.（2020）

本视频展示了利用蔗糖梯度超速离心法分离革兰氏阴性菌的内膜和外膜组分。膜组分经纯化后于低温保存，用于针对膜特异性组分的靶向分析。

方案

1. 膜提取所需常规试剂与培养基的制备

1. 细菌培养基：在彻底清洁并经高压灭菌的 2 L 三角瓶中制备并灭菌 1 L 液体培养基。
2. 通用重悬缓冲液（1 M 三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液（Tris 缓冲液），pH 7.5；50 mL）：将 6.05 g Tris 碱溶解于 30 mL H₂O 中，用 5 M HCl 调节 pH 至 7.5，再用超纯 H₂O 定容至 50 mL。
3. 二价阳离子螯合溶液母液（0.5 M 乙二胺四乙酸，EDTA，pH 8；100 mL）：将 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠盐·2H₂O 加入 80 mL H₂O 中，剧烈搅拌，并用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0，再用超纯 H₂O 定容至 100 mL。
   注意：EDTA 的二钠盐在加入 NaOH 将溶液 pH 调至约 8.0 之前不会溶解。
4. 渗透缓冲液 A（0.5 M 蔗糖，10 mM Tris，pH 7.5；1 L）：称取 171.15 g 蔗糖，转移至 1 L 量筒中，加入 10 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5），用超纯 H₂O 定容至 1 L，4 °C 保存。
5. 溶菌酶溶液（10 mg/mL；5 mL）：称取 50 mg（鸡蛋清）溶菌酶，溶于 5 mL 超纯 H₂O 中，4 °C 保存。
6. 稀释的二价阳离子螯合溶液（1.5 mM EDTA；500 mL）：取 1.3 步骤中的 0.5 M EDTA 溶液 1.5 mL，加入 497.5 mL 超纯 H₂O 中，4 °C 保存。
7. 渗透缓冲液 B（0.2 M 蔗糖，10 mM Tris，pH 7.5；2 L）：称取 136.8 g 蔗糖，转移至 2 L 量筒中，加入 20 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5），用超纯 H₂O 定容至 2 L，4 °C 保存。
8. 核酸酶辅因子（1 M 氯化镁，MgCl₂；10 mL）：将 2.03 g MgCl₂·6H₂O 溶解于 8 mL 超纯 H₂O 中，定容至 10 mL，室温保存。
9. 含 RNase 和 DNase 酶的核酸酶溶液混合物：见材料表，-20 °C 保存。
10. 蛋白酶抑制剂混合物：见材料表，4 °C 保存。
11. 低密度等密度蔗糖梯度溶液（20% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 20 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H₂O 定容至 100 mL，室温保存。
12. 中密度等密度蔗糖梯度溶液（53% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 53 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H₂O 定容至 100 mL，室温保存。
    注意：由于蔗糖浓度较高，需在量筒中配制以确保准确性。加入磁力搅拌子并持续搅拌，直至蔗糖完全溶解，此过程可能需要数小时。
13. 高密度等密度蔗糖梯度溶液（73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 73 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H₂O 定容至 100 mL，室温保存。
    注意：由于蔗糖浓度较高，需在量筒中配制以确保准确性。加入磁力搅拌子并持续搅拌，直至蔗糖完全溶解，此过程可能需要数小时。
14. 分离膜保存缓冲液（10 mM Tris 缓冲液，pH 7.5；1 L）：取 1 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）加入 1 L 三角瓶中，用超纯 H₂O 定容至 1 L。

2. 膜提取用细菌的制备

1. 从冻存的甘油菌种中划线接种细菌至新鲜的琼脂平板上。待菌落形成后，将平板置于 4 °C 保存。挑取单个菌落接种于装有 5 mL 液体培养基的试管中，根据需要过夜培养细菌。
2. 将过夜培养的细菌培养物反向稀释至1升适宜的液体培养基中，继续培养细菌直至达到所需光密度。
   注意： 建议将单个细菌菌落接种至1 L液体培养基中，适用于易出现生长表型抑制的突变基因型；但某些革兰氏阴性菌本身的生长速度较其他菌种更慢。若通过单菌落接种无法达到足够的培养密度，可采用将过夜培养物回稀释至1 L培养基中的方法，以同步细菌生长。细菌细胞膜的组成会随培养物的生长阶段（对数期与稳定期）而变化。应对所有菌株进行生长曲线测定，即测量细菌培养物在不同时间点的光密度变化，以建立培养密度与生长阶段之间的对应关系。 关键词：细菌菌落，液体培养基，突变基因型，生长表型抑制，革兰氏阴性菌，生长速度，培养密度，过夜培养物，回稀释，生长同步化，细胞膜组成，生长阶段，对数期，稳定期，生长曲线，光密度
3. 将含有肉汤培养物的烧瓶置于冰上。在600 nm波长下测定光密度（OD₆₀₀）并计算相当于 6.0 至 8.0 × 10 的培养物体积¹¹ 细菌菌落形成单位（CFU）。对于 S. 鼠伤寒沙门氏菌，这相当于1 L培养液在OD值为₆₀₀ 在0.6至0.8之间，因为OD600为1.0时约等于1.0×10⁹ CFU/mL。将此体积加入离心管中，并确保剩余的培养物在使用前始终置于冰上。
4. 在 4 °C 下以 7,000–10,000 x g 离心收集细菌沉淀 g 在固定角高速离心机中离心10分钟。
   注意： 预先将离心机冷却并保持在低温状态。整个操作过程中，样品需始终置于冰上。
5. 小心地倾去并弃去上清液。
   注意： 如果膜组分不立即进行提取，可将沉淀快速冷冻并在-80 °C保存。然而，建议在收获细胞的当天直接进行质壁分离，尤其是对于非肠杆菌类物种。

3. 外膜解离与质壁分离

1. 如果细胞沉淀先前保存在 -80 °C，需在冰上解冻，并在后续操作过程中始终保持样品置于冰上。在离心管中用 12.5 mL 缓冲液 A 重悬每个细胞沉淀。向细胞悬液中加入一个磁力搅拌子。
2. 向每份细胞重悬液中加入 180 µL 的 10 mg/mL 溶菌酶（终浓度为 144 μg/mL）。在冰上搅拌 2 分钟，期间保持样品处于冰上。
3. 向每份细胞重悬液中加入 12.5 mL 的 1.5 mM EDTA 溶液，并继续在冰上搅拌 7 分钟。
4. 将悬液倒入 50 mL 锥形离心管中，在 4 °C 下以 9,000–11,000 × g 离心 10 分钟。
5. 将上清液弃入生物危害废物容器中，细胞沉淀则保留在冰上。
6. 向细胞沉淀中加入 25 mL 缓冲液 B。
7. 在覆盖于细胞沉淀上方的缓冲液 B 中加入 55 µL 的 1 M MgCl₂、1 µL RNase/DNase 核酸酶试剂（以避免细菌在均质化前发生质壁分离所导致的黏度问题）以及 1 µL 蛋白酶抑制剂混合物。
8. 用缓冲液 B 混合液重悬沉淀。剧烈移液并涡旋震荡，直至形成均匀的溶液。
   注意：在进入本方案的第 4 步之前，确保溶液均匀至关重要。重悬后的细胞应呈现类似蛋糕面糊的黏稠外观和质地。
9. 每份样品涡旋震荡 15 秒。将悬液保持在冰上，并进入第 4 步。

4. 加压均质化与裂解
注意：多种方法可用于裂解。超声处理因产热而不理想。渗透裂解虽可实现，但通常效率较低。因此，我们推荐采用高压裂解。高压裂解可通过多种仪器实现。我们建议使用均质化设备，例如法国压滤器（French Press）或Emusliflex。我们研究多种革兰氏阴性菌，其对高渗蔗糖溶液的反应各不相同。高压均质化步骤可提高效率、重复性和得率。

1. 将法国压滤器细胞室预冷至 4 °C，或将匀浆机的金属线圈置于冰上。
2. 将样品倒入法国压滤器细胞室或匀浆机样品管中，并将细胞室升至所需的匀浆压力（使用法国压滤器时通常为 10,000 psi，使用匀浆机时为 20,000 psi）。
3. 若使用法国压滤器，应在维持压力的同时，调节出口流速至大约每秒一滴。
4. 将细胞裂解液收集至 50 mL 锥形管中，并始终保持样品处于冰上。
5. 重复步骤 4.2–4.4 三到五次，以实现完全裂解，通常以样品透明度逐渐增加作为判断依据。
   注意：样品室在不同样品之间应使用缓冲液 B 进行清洗并平衡。
6. 将已裂解的细胞保持在冰上。

5. 全膜组分分离

1. 将裂解的细菌样品在 4 °C 条件下以 6,169 × g 离心 10 分钟，使未完全裂解的完整细胞物质（例如未裂解的细菌细胞）形成沉淀。
2. 将含有均质化膜组分的上清液转移至聚碳酸酯瓶中，用于超速离心。
   注意：如有需要，可通过加入缓冲液 B 稀释样品以平衡离心管。
3. 在 4 °C 条件下，以 184,500 × g 对细胞裂解物进行超速离心，至少离心 1 小时。此步骤可过夜进行，不会影响膜的质量。
4. 弃去超速离心管中残留的上清液，将膜沉淀保留在冰上（图 1）。
5. 使用玻璃Dounce匀浆器将膜沉淀重悬于 1 mL 低密度等密度蔗糖梯度溶液中。用玻璃巴斯德吸管将样品匀浆转移至 1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上保存。
   注意：若仅需进行总膜组分分析，可用 1 mL 膜储存缓冲液替代 1 mL 低密度等密度蔗糖梯度溶液。若仅需获取总细菌膜样品，则第 5.5 步即为分离终点。样品可于 -20 °C 保存，直至后续分析使用。

6. 密度梯度超速离心法分离双层膜

1. 收集适量的13 mL聚丙烯或超透明开口管，这些离心管需适用于摆动桶转子和超速离心机。
2. 将离心管保持在略微倾斜的位置，按以下顺序从高密度到低密度缓慢加入蔗糖溶液，以制备蔗糖梯度：2 mL 73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5；4 mL 53% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5
   1. 接下来，加入已重悬于20% w/v蔗糖溶液中的总膜组分（1 mL）（步骤5.5）。注意避免将膜组分与下方的蔗糖溶液混合。各层之间应能观察到清晰的分界。
   2. 最后，用低密度等密度蔗糖梯度溶液（约6 mL）填充离心管。聚丙烯和超透明开口管应尽可能装满（距管口2至3 mm），以提供管体支撑。
3. 校正 鲍曼不动杆菌 17978
   1. 针对不同细菌样本，调整并使用优化的蔗糖梯度。 A. baumannii，以下蔗糖梯度可实现膜的更完全分离（图22 mL 73%（w/v）蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris（pH 7.5）；4 mL 45%（w/v）蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris（pH 7.5）
   2. 接下来，加入已重悬于20%（w/v）蔗糖溶液中的总膜组分（1 mL）（步骤5.5）。注意避免将膜组分与下方的蔗糖溶液混合。各层之间应能观察到清晰的分界。
   3. 最后，用低密度等密度蔗糖梯度溶液（约6 mL）填充离心管。聚丙烯和超透明开口离心管应尽可能装满（距管口2至3 mm），以提供管体支撑。
4. 使用水平转子在288,000 x g条件下超速离心样品 g 4 °C 下过夜。
   注意： 对于前几步中使用的体积，我们建议离心时间为16 h至23 h。
5. 从P1000吸头尖端约5 mm处剪断。使用该吸头去除上层的棕褐色内膜（IM）层。将IM组分转移至聚碳酸酯管中，用于超速离心。
6. 在53-73%蔗糖溶液界面以上保留约2 mL蔗糖溶液，以确保下层白色外膜（OM）不被内膜（IM）组分交叉污染。重复步骤6.4中的移液操作，用于收集外膜（OM）组分（图1).
   注意： 也可用针头穿刺离心管底部，逐滴收集膜组分。
7. 用分离膜储存缓冲液填满超速离心管中剩余的空隙，通过倒置或移液混匀。将样品置于冰上保存。
8. 通过超速离心在 184,500 x g 条件下收集现已洗涤并分离的膜 g 4 °C下孵育1小时。
9. 弃去上清液，用Dounce匀浆器重悬膜沉淀。加入500–1000 μL储存缓冲液。将样品收集至2 mL微量离心管中。
10. 将细菌膜样品在 -20 °C 下保存。

结果

图1：本方法文章所述革兰氏阴性细菌膜分离流程的示意图。 图中展示了收集细菌细胞并分离总膜、内膜（IM）和外膜（OM）的步骤。该方法基于此类微生物的外膜双层结构密度高于内膜双层结构密度的特性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 离心瓶，PC/PPCO 材质，超高速，带密封盖，Nalgene	VWR	525-0466
1 L Pyrex 培养基储存瓶，耐高温瓶盖	VWR	10416-312
2000 mL 窄口锥形瓶	VWR	10545-844
4-20% mini PROTEAN 预制蛋白凝胶，12 孔	BIORAD	4561095
4x Laemmli 样品缓冲液，10 mL	BIORAD	1610747
50 mL 无菌聚丙烯离心管	VWR	89049-174
7 mL Dounce 组织匀浆器，配两个玻璃研杵	VWR	71000-518
70 mL 聚碳酸酯瓶组件	Beckman Coulter Life Sciences	355622
琼脂粉	VWR	A10752
B10P 台式 pH 计，配 pH 探头	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC（台式）	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase 核酸酶	MilliporeSigma	70746-3
EDTA 二钠盐二水合物 99.0-101.0%，晶体，超纯生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy 固定角转子	ThermoFisher Scientific	75006526
盐酸 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI scientific 轨道平台摇床	Fischer Scientific	15-453-211
LB 肉汤 Miller 培养基	VWR	214906
溶菌酶，鸡蛋清来源，超纯级	VWR	VWRV0063
六水合氯化镁	Sigma Aldrich	M2670
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
蛋白酶 -50，无 EDTA	G Biosciences	786-334
氢氧化钠 ≥99.99%	VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus 离心机	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
蔗糖	MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter Life Sciences	331362
三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS，Trometamol）≥99.9%（干燥基），超纯生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Type 45 Ti 固定角钛转子	Beckman Coulter Life Sciences	339160
超透明离心管，14 x 89 mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	VWR	102091-234