革兰氏阴性菌内膜和外膜组分的分离

摘要

资料来源：Cian， M. B. 等人，鲍曼不动杆菌的革兰氏阴性菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分，并进行技术调整。J. Vis. Exp.（2020年）

该视频演示了使用蔗糖梯度超速离心分离革兰氏阴性菌的内膜和外膜部分。膜馏分在低温下纯化和储存，以靶向分析膜特异性成分。

方案

1. 膜提取的通用试剂和培养基制备

细菌

1. 生长培养基：在彻底清洁和高压灭菌的 2 L 烧瓶中制备并灭菌 1 L 肉汤培养基。
2. 一般重悬缓冲液（1 M Tris（羟甲基）氨基甲烷缓冲液（Tris 缓冲液）pH 7.5;50 mL）：将 6.05 g Tris 碱溶解在 30 mL H₂O 中，用 5 M HCl 将 pH 值调节至 7.5，用超纯 H₂O 将最终体积调节至 50 mL。
3. 二价阳离子螯合液（0.5M乙二胺四乙酸，EDTA pH 8;100mL）主储备液：将18.6 g乙烯四乙酸二钠·2H₂O加入80 mL H₂O中，剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至8.0。用超纯H₂O.
   将最终体积调节至100mL注意：在通过添加NaOH将溶液的pH值调节至~8.0之前，EDTA的二钠盐不会溶解。
4. 渗透缓冲液A（0.5 M蔗糖，10 mM Tris pH 7.5;1 L）：称取171.15 g蔗糖并将其转移到1 L圆柱体中。加入 10 mL 1 M Tris pH 7.5。用超纯H₂O调节至1 L的最终体积，储存在4°C。
溶
5. 菌酶（10mg/mL;5mL）：称取50mg（鸡蛋清）溶菌酶，溶解在5mL超纯H₂O中，储存在4°C。
6. 稀释的二价阳离子螯合溶液（1.5 mM EDTA;500 mL）：将 1.5 mL 的 0.5 M EDTA（步骤 1.3）加入 497.5 mL 超纯 H₂O，储存在 4 °C。
7. 渗透缓冲液 B（0.2 M 蔗糖，10 mM Tris pH 7.5;2 L）：称取 136.8 g 蔗糖并将其转移到 2 L 圆柱体中。加入 20 mL 1 M Tris pH 7.5。用超纯H₂O将最终体积调节至2 L，储存在4°C。
8. 核酸酶辅助因子（1 M 氯化镁，MgCl₂;10 mL）：将 2.03 g MgCl₂·6H₂O 溶解在 8 mL 超纯 H₂O 中，将体积调节至 10 mL。在室温下储存。
9. 核酸酶溶液混合物，包括RNase和DNase酶：参见 材料表。储存在-20°C。
10. 蛋白酶抑制剂混合物：参见 材料表。储存在 4 °C。
11. 低密度等密度蔗糖梯度溶液（20% w / v蔗糖，1mM EDTA，1mM Tris pH 7.5溶液;100mL）：称取20g蔗糖并转移到200mL圆柱体中。加入 100 μL 1 M Tris 缓冲液 pH 7.5 和 200 μL 0.5 M EDTA pH 8。用超纯H₂O将最终体积调整至100mL，在室温下储存。
12. 中密度等密度蔗糖梯度溶液（53% w/v 蔗糖、1 mM EDTA、1mM Tris pH 7.5 溶液;100 mL）：称取 53 g 蔗糖并转移到 200 mL 量筒中。加入 100 μL 1 M Tris 缓冲液 pH 7.5 和 200 μL 0.5 M EDTA pH 8。用超纯H₂O将最终体积调整至100mL，在室温下储存。
    注意：在量筒中制备该溶液，以确保由于蔗糖含量高而准确。加入磁力搅拌棒并搅拌直至蔗糖完全溶解在溶液中。此过程可能需要几个小时。
13. 高密度等密度蔗糖梯度溶液（73% w/v 蔗糖、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5 溶液;100 mL）：称取 73 g 蔗糖并转移到 200 mL 量筒中。加入 100 μL 1 M Tris 缓冲液 pH 7.5 和 200 μL 0.5 M EDTA pH 8。用超纯H₂O将最终体积调整至100mL，在室温下储存。
    注意：在量筒中制备该溶液，以确保由于蔗糖百分比高而准确。加入磁力搅拌棒并搅拌直至蔗糖完全溶解。此过程可能需要几个小时。
分离
14. 膜储存缓冲液（10 mM Tris 缓冲液 pH 7.5;1 L）：将 1 mL 1 M Tris 缓冲液 pH 7.5 加入 1 L 烧瓶中，并用超纯 H₂O 将最终体积调节至 1 L。

2. 用于膜提取的细菌的制备

将

1. 细菌从冷冻甘油储备液中划到新鲜琼脂平板上。菌落发育后将板储存在4°C。将单个菌落接种到装有肉汤培养基的 5 mL 管中，并根据需要培养细菌过夜。
将
2. 过夜细菌培养物反稀释到1 L首选肉汤培养基中，并培养细菌，直到达到所需的光密度。
   注意：对于容易抑制生长表型的突变基因型，建议将单个细菌菌落接种到1 L肉汤培养基中，但某些革兰氏阴性菌的生长速度比其他细菌慢。如果无法通过单菌落接种获得足够的培养密度，则将过夜培养物反稀释到1L培养基中是同步生长的一种策略。细菌膜组成因培养物的生长期（对数期与静止期）而异。应对所有菌株进行测量细菌培养物光密度随时间变化的生长曲线，以将培养密度与生长阶段相关联。
将
3. 装有肉汤培养物的烧瓶放在冰上。读取 600 nm 处的光密度 （OD₆₀₀） 并计算相当于 6.0 至 8.0 x 10¹¹ 个细菌菌落形成单位 （CFU） 的培养体积。对于鼠伤寒沙门氏菌，这相当于 1 L OD₆₀₀ 在 0.6 - 0.8 之间的培养物，因为 OD600 为 1.0 大约等于 1.0x10⁹ CFU/mL。将该体积添加到离心管中，并确保剩余的培养物在使用之前保持在冰上。
4. 通过在固定角度高速离心机中以7,000-10,000 x g在4°C下离心10分钟来沉淀细菌。
   注意：预冷并将离心机保持在低温。在整个过程中将样品保持在冰上。
小心
5. 地倒出并丢弃上清液。
   注意：如果不打算立即提取膜组分，可以将沉淀快速冷冻和/或储存在-80°C。然而，建议在收获细胞的同一天直接进行浆裂解，特别是对于非肠杆菌物种。

3. 外膜的解离和等离子体溶解

如果细胞

1. 沉淀之前储存在 -80 °C 下，则在冰上解冻，并在其余程序中将样品保留在冰上。将离心管内的每个细胞沉淀重悬于 12.5 mL 缓冲液 A 中。在细胞悬液中加入磁性搅拌棒。
向
2. 每个细胞重悬液中加入 180 μL 10 mg/mL 溶菌酶（终浓度为 144 μg/mL）。将样品放在冰上，同时搅拌 2 分钟。
向
3. 每个细胞重悬液中加入 12.5 mL 1.5 mM EDTA 溶液，并在冰上继续搅拌 7 分钟。
将
4. 悬浮液倒出到 50 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 9,000-11,000 x g 离心 10 分钟。
将
5. 上清液丢弃到生物危害废物容器中，并将沉淀保留在冰上。
向
6. 细胞沉淀中加入 25 mL 缓冲液 B。
7. 加入 55 μL 1 M MgCl₂、1 μL RNase/DNase 核酸酶试剂（以避免与均质化前进行浆裂的细菌相关的粘度问题）和 1 μL 蛋白酶抑制剂混合物到位于细胞沉淀顶部的缓冲液 B 体积中将
8. 沉淀重悬于缓冲液 B 混合物中。用力移液并涡旋，直到观察到均匀的溶液。
   注意：在继续本协议的步骤4之前，拥有均匀的溶液非常重要。重悬的细胞应具有粘稠的蛋糕面糊状外观和稠度。
涡
9. 旋每个样品 15 秒，将悬浮液保留在冰上并继续执行步骤 4。

4. 加压均质化和裂解
注意：可以使用几种方法进行裂解。由于产生热量，超声处理并不理想。渗透裂解是可以实现的，但通常效率低下。因此，我们建议进行高压裂解。可以使用多种仪器实现高压裂解。我们建议使用均质机，例如法式压榨机或 Emusliflex。我们与多种类型的革兰氏阴性菌合作，这些细菌对高渗透压蔗糖溶液的反应各不相同。高压均质步骤提高了效率、可重复性和产量。

将

1. 法式压榨机池在4°C下预冷，或将均质机中的金属线圈插入冰上。
2. 将样品倒入法式压力池或均质器样品筒中，并将池置于所需的均质压力下（使用法式压榨机时 10,000 psi 应足够，使用均质器时应为 20,000 psi）。
3. 如果使用法式压榨机，请将出口流量调整到大约每秒一滴，同时保持压力。
将
4. 细胞裂解物收集在 50 mL 锥形管中，同时将样品保存在冰上。
5. 重复步骤4.2-4.4三到五次以达到完全裂解，这通常表现为样品透明度逐渐增加。
   注意：样品室应在样品之间用缓冲液B清洗和平衡。
6. 将裂解的细胞放在冰上。

5. 全膜分离

1. ：将裂解的细菌样品在 4 °C 下以 6,169 x g 离心 10 分钟，以沉淀剩余的完整细胞材料。（例如，未裂解的细菌细胞）。
将
2. 上清液的剩余部分（现在包含均质膜）分配到聚碳酸酯瓶中进行超速离心。
   注意：如果需要，可以通过用缓冲液 B 稀释来平衡细胞样品。
在
3. 4°C下以184,500 x g 超速离心细胞裂解物至少1小时。此步骤可以在一夜之间进行，而不会影响膜的质量。
4. 丢弃超速离心管中存在的剩余上清液，并将膜沉淀保留在冰上（图1）。
5. 使用玻璃-Dounce均质器将膜沉淀重悬于1mL低密度等密度蔗糖梯度溶液中。使用玻璃巴斯德移液器将样品匀浆转移到 1.5 mL 微量离心管中并保留在冰上。
   注意：如果只需要全膜成分分析，请用 1 mL 低密度等密度蔗糖梯度溶液代替 1 mL 分离的膜储存缓冲液。如果只需要总细菌膜样品，步骤 5.5 是分离的终点。将样品储存在-20°C，直到需要进一步的下游分析。

6. 密度梯度超速离心以分离双膜

1. 收集适当数量的 13 mL 聚丙烯或超透明开顶管，指定用于摆动桶转子和超速离心机。
将
2. 试管保持在稍微倾斜的位置，并通过按以下顺序从高密度到低密度缓慢加入蔗糖溶液来制备蔗糖梯度：2 mL 73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.54 mL 53% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5
   1. 接下来， 加入已重悬于20%w / v蔗糖溶液中的总膜部分（1mL）（步骤5.5）。避免将膜组分与其下方的蔗糖溶液混合。每个层之间应该可以看到划分。
   2. 最后，用低密度等密度蔗糖梯度溶液（约6mL）填充试管。聚丙烯和超透明开顶管应尽可能装满（距管顶 2 或 3 毫米）以支撑管子。
鲍
3. 曼不动杆菌 17978 的调整
   1. 调整调整后的蔗糖梯度以用于不同的细菌标本。对于鲍曼不动杆菌，以下蔗糖梯度提供了更完全的膜分离（图 2）。2 mL 73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.54 mL 45% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5
   2. 接下来，加入已重悬于 20% w/v 蔗糖溶液中的总膜组分 （1 mL）（步骤 5.5）。避免将膜组分与其下方的蔗糖溶液混合。每个层之间应该可以看到划分。
   3. 最后，用低密度等密度蔗糖梯度溶液（约6mL）填充试管。聚丙烯和超透明开顶管应尽可能装满（距管顶 2 或 3 毫米）以支撑管子。
4. 使用摆动桶转子在 288,000 x g 和 4 °C 下对样品进行超速离心过夜。
   注意：对于前面步骤中使用的体积，我们建议离心时间在 16 小时到 23 小时之间。
将
5. P1000 移液器吸头的末端切开距该点约 5 毫米。使用移液器，去除上棕色内膜 （IM） 层。将IM馏分转移到聚碳酸酯瓶中进行超速离心。
在
6. 53-73%界面上方留下约2mL的蔗糖溶液，以确保下白色外膜（OM）不会被IM组分交叉污染。对OM馏分重复步骤6.4的移液程序（图1）。
   注意：也可以通过用针刺穿底部的离心管并将它们作为馏分滴加来收集膜。
7. 用分离的膜储存缓冲液填充超速离心管的剩余空隙，并通过倒置或移液混合。将样品保留在冰上。
8. 通过在4°C下以184,500 x g 超速离心1小时收集现在洗涤和分离的膜。
弃
9. 去上清液并通过 Dounce 均质化重悬膜。加入 500-1000 μL 储存缓冲液。在 2 mL 微量离心管中收集样品。
将
10. 细菌膜样品储存在-20°C。

结果

图 1：描述本方法文章中描述的革兰氏阴性菌膜分离程序的示意图。 显示了用于收集细菌细胞和分离总膜、内膜（IM）和外膜（OM）的程序。与IM双层的密度相比，该方法依赖于这些微生物的OM双层密度的增加。

材料