革兰氏阴性菌内膜与外膜组分的分离

摘要

来源：Cian, M. B. 等.，将革兰氏阴性细菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分，并针对Acinetobacter baumannii进行技术优化。J. Vis. Exp.（2020）

本视频展示了利用蔗糖梯度超速离心法分离革兰氏阴性菌的内膜和外膜组分。膜组分经纯化后于低温保存，用于针对膜特异性组分的靶向分析。

方案

1. 膜提取所需常规试剂与培养基的制备

1. 细菌培养基：在彻底清洁并经高压灭菌的 2 L 三角瓶中制备并灭菌 1 L 液体培养基。
2. 通用重悬缓冲液（1 M 三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液（Tris 缓冲液），pH 7.5；50 mL）：将 6.05 g Tris 碱溶解于 30 mL H₂O 中，用 5 M HCl 调节 pH 至 7.5，再用超纯 H₂O 定容至 50 mL。
3. 二价阳离子螯合溶液母液（0.5 M 乙二胺四乙酸，EDTA，pH 8；100 mL）：将 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠盐·2H₂O 加入 80 mL H₂O 中，剧烈搅拌，并用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0，再用超纯 H₂O 定容至 100 mL。
   注意：EDTA 的二钠盐在加入 NaOH 将溶液 pH 调至约 8.0 之前不会溶解。
4. 渗透缓冲液 A（0.5 M 蔗糖，10 mM Tris，pH 7.5；1 L）：称取 171.15 g 蔗糖，转移至 1 L 量筒中，加入 10 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5），用超纯 H₂O 定容至 1 L，4 °C 保存。
5. 溶菌酶溶液（10 mg/mL；5 mL）：称取 50 mg（鸡蛋清）溶菌酶，溶于 5 mL 超纯 H₂O ....

结果

图1：本方法文章所述革兰氏阴性细菌膜分离流程的示意图。 图中展示了收集细菌细胞并分离总膜、内膜（IM）和外膜（OM）的步骤。该方法基于此类微生物的外膜双层结构密度高于内膜双层结构密度的特性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 离心瓶，PC/PPCO 材质，超高速，带密封盖，Nalgene	VWR	525-0466
1 L Pyrex 培养基储存瓶，耐高温瓶盖	VWR	10416-312
2000 mL 窄口锥形瓶	VWR	10545-844
4-20% mini PROTEAN 预制蛋白凝胶，12 孔	BIORAD	4561095
4x Laemmli 样品缓冲液，10 mL	BIORAD	1610747
50 mL 无菌聚丙烯离心管	VWR	89049-174
7 mL Dounce 组织匀浆器，配两个玻璃研杵	VWR	71000-518
70 mL 聚碳酸酯瓶组件	Beckman Coulter Life Sciences	355622
琼脂粉	VWR	A10752
B10P 台式 pH 计，配 pH 探头	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC（台式）	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase 核酸酶	MilliporeSigma	70746-3
EDTA 二钠盐二水合物 99.0-101.0%，晶体，超纯生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy 固定角转子	ThermoFisher Scientific	75006526
盐酸 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI scientific 轨道平台摇床	Fischer Scientific	15-453-211
LB 肉汤 Miller 培养基	VWR	214906
溶菌酶，鸡蛋清来源，超纯级	VWR	VWRV0063
六水合氯化镁	Sigma Aldrich	M2670
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
蛋白酶 -50，无 EDTA	G Biosciences	786-334
氢氧化钠 ≥99.99%	VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus 离心机	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
蔗糖	MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter Life Sciences	331362
三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS，Trometamol）≥99.9%（干燥基），超纯生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Type 45 Ti 固定角钛转子	Beckman Coulter Life Sciences	339160
超透明离心管，14 x 89 mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	VWR	102091-234