利用仿生微珠评估细菌-宿主细胞相互作用

摘要

来源：Stones, D. H., 等. 用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料. J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了在竞争条件下，使用模拟细菌的微珠定量细菌对宿主上皮细胞黏附的方法。视频概述了处理细胞、裂解细胞以及通过梯度稀释涂布平板以测定菌落形成单位的各个步骤。

方案

1. 细菌黏附的测定
   1. 在指定时间点（例如，感染后1小时），移除细胞层中的培养基。
   2. 用无菌预温的磷酸盐缓冲液（PBS）彻底清洗细胞层（每次1 ml PBS，至少清洗3–4次），以去除未黏附的细胞。
   3. 通过向每孔加入1 ml无菌的含1% v/v Triton X-100的PBS溶液裂解宿主细胞。将培养板在37 °C孵育5分钟。
   4. 在将每孔内容物转移至独立的1.5 ml离心管前，用移液器反复吹打各样品数次。用无菌PBS对样品进行10倍系列稀释（例如，取100 ml样品与900 ml PBS混合）。
   5. 取每份样品100 μl接种于海水Luria-Bertani（MLB）琼脂平板，用细胞涂布器涂布均匀。根据细菌菌株和时间点优化接种的稀释倍数。
      注意：在所述实验条件下，10⁵或10⁶倍稀释可获得适宜的菌落形成单位（CFUs）数量。
   6. 将平板在37 °C过夜孵育，并通过菌落计数定量细菌数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
羧基修饰聚苯乙烯微球	Sigma	CLB9	有害；可提供多种粒径和颜色的替代产品
杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖 - 含4500 mg/L葡萄糖和碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红，液体，无菌过滤，适用于细胞培养	Sigma	D1145	用于感染实验
DMEM	Sigma	D6429	用于培养宿主细胞的维持
胎牛血清，热灭活	Sigma	F9665	组织培养基的添加物
青霉素-链霉素溶液 - 稳定化，含10,000单位青霉素和10 mg链霉素/mL，无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养	Sigma	F9665	组织培养基的添加物
PBS	Sigma	D8537
塑料器皿
24孔板	Greiner	662160
设备
组织培养设施
多通道移液器