一种用于定量细菌中无机多聚磷酸盐的检测方法

摘要

来源：Pokhrel, A., et al. 细菌中无机多聚磷酸盐的检测。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种比色法，用于测定细菌样品中的无机多聚磷酸盐（polyP）。该方法通过酶促反应将polyP转化为游离磷酸盐，后者再与钼酸盐和抗坏血酸反应生成蓝色复合物。通过将该复合物的吸光度与已知磷酸盐浓度的标准曲线进行比较，可准确量化细菌样品中的polyP含量。

方案

1. 聚磷酸盐提取样品的采集

1. 在感兴趣的条件下培养细菌以测定其聚磷酸盐（polyP）含量。本实验方案中，将Lactobacillus reuteri在不含半胱氨酸的苹果酸酶诱导（MEI-C）培养基中，于37 °C静置过夜培养。
2. 通过离心收集足够数量的细胞，置于1.5 mL微量离心管中，使总细胞蛋白量达到50 – 100 µg（见下文步骤3）。对于E. coli，取A₆₀₀为0.2 - 0.4的对数生长期培养物1 mL；对于L. reuteri，取1 mL过夜培养物。根据其他目标菌种的具体情况相应调整。
3. 彻底移除细胞沉淀中的上清液。
4. 将细胞沉淀重悬于250 µL GITC裂解缓冲液（4 M异硫氰酸胍，50 mM Tris-HCl，pH 7）中，于95 °C孵育10分钟以实现裂解。将裂解产物储存于-80 °C。
   注意：裂解时间应保持一致，因高温长时间孵育可能导致聚磷酸盐通过水解而降解。裂解产物可在-80 °C长期保存。
   注意：异硫氰酸胍为变性盐类，操作时应佩戴手套，并按有害废弃物处置。

2. 测定细胞裂解液的蛋白质含量

1. 在GITC裂解缓冲液中配制含有0、0.1、0.2和0.4 mg mL^-1 BSA的牛血清白蛋白（BSA）标准品。
   注意：必须在GITC中配制BSA标准品，因为GITC会影响Bradford法显色反应。BSA标准品可在-20 °C长期保存。
2. 取5 µL解冻后充分混匀的细胞裂解液及BSA标准品，分别加入透明96孔板的不同孔中。
3. 每孔加入195 µL Bradford试剂，使用酶标仪在595 nm处测定吸光度（A₅₉₅）（参见材料表）。
4. 根据BSA标准曲线，使用公式 y = mx + b 计算每孔中的蛋白含量，其中 y 为A₅₉₅，x 为BSA的微克数（µg），m 为标准曲线的斜率，b 为标准曲线的y轴截距。将计算结果乘以0.05，得到每个样品中的总蛋白毫克数（mg）。

提取多聚磷酸盐

1. 向每个 GITC 裂解的样品中加入 250 µL 95% 乙醇，并涡旋混匀。
2. 将该混合物加入硅胶膜离心柱中，在 16,100 × g 条件下离心 30 秒。
3. 弃去穿流液，然后加入 750 µL 含 5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、50 mM NaCl、5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 50% 乙醇的溶液，在 16,100 × g 条件下离心 30 秒。
4. 弃去穿流液，在 16,100 × g 条件下再离心 2 分钟。
5. 将柱子放入一个洁净的 1.5 mL 微量离心管中，加入 150 µL 50 mM Tris-HCl（pH 8）。
6. 室温孵育 5 分钟，然后在 8,000 × g 条件下离心 2 分钟以洗脱多聚磷酸盐（polyP）。
   注意：如有需要，洗脱液可在 -20 °C 下保存至少 1 周。

4. 多聚磷酸盐的消化

1. 在50 mM Tris-HCl（pH 8）中配制含0、5、50或200 µM磷酸钾的标准溶液。
   注意： 磷酸钾标准品可在室温下长期保存。
2. 将每种磷酸盐标准品和提取的聚磷酸盐样品各100 µL分装至透明96孔板的不同孔中。
3. 配制主混合液（每份样品）：30 µL 5x ScPPX反应缓冲液（100 mM Tris-HCl，25 mM MgCl₂）₂，250 mM 乙酸铵，pH 7.5）13，19 µL H₂O 和 1 µL 纯化的 ScPPX（1 mg mL-1）。
4. 向96孔板的每个孔中加入50 µL预混液。在37 °C孵育15分钟。
   注意： 如有需要，消化后的 polyP 样品可于 -20 °C 长期保存。

5. 检测游离磷酸盐

1. 通过将0.185 g酒石酸锑钾溶解于200 mL水中，加入150 mL 4 N H₂SO₄，再加入1.49 g钼酸铵，配制检测试剂基础液。搅拌至完全溶解后，定容至456 mL。过滤溶液以去除颗粒物，并在4 °C避光保存，可保存最多1个月。
2. 配制1 M抗坏血酸储备液。避光保存于4 °C，可保存最多1个月。
3. 每天新鲜配制检测试剂工作液，将9.12 mL检测试剂基础液与0.88 mL 1 M抗坏血酸混合。使用前使检测试剂恢复至室温。
4. 向96孔板中的每个样品和标准品孔中加入50 µL检测试剂，室温孵育约2分钟，以使显色反应进行。
5. 使用酶标仪在882 nm处测定吸光度，并通过与磷酸钾标准曲线比较，计算各样品的磷酸盐浓度。
   注意：检测试剂含有有毒盐类和强酸。操作时需佩戴手套，并将过量试剂作为有毒废物处理。

6. 计算细胞内多聚磷酸盐含量

1. 根据以下公式，将步骤 5.5 中测定的磷酸盐浓度转换为每份完整细胞裂解液中多聚磷酸盐（polyP）来源的磷酸盐的纳摩尔数（nmol）：
   nmol polyP = 1.5 × (µM 磷酸盐 / 10)
   注意： 步骤 5 中基于标准曲线的方法测定的是在步骤 4.2 中分装的每份 100 µL 多聚磷酸盐样品中磷酸盐的浓度（以 µM 计）。为将该浓度转换为纳摩尔数，需将 100 µL 除以 10⁶ 得到以 L 为单位的体积，再乘以浓度（µmol L^-1），然后乘以 1,000（即每 µmol 中的 nmol 数）。该计算可简化为将浓度除以 10。步骤 3 中制备的总提取液体积为 150 µL，因此需将所得数值乘以 1.5，以计算整个提取液中所含磷酸盐的 nmol 数。
2. 通过将每份样品中 polyP 的 nmol 数除以步骤 1.4 中测定的总蛋白质量（mg），将细胞内 polyP 含量归一化为总细胞蛋白。polyP 水平以单个 polyP 来源的游离磷酸盐浓度表示。
   注意： 在某些情况下，样品中 polyP 来源的磷酸盐含量可能超出磷酸盐标准曲线的线性范围。若 polyP 水平非常高，可将步骤 3.6 中含过量 polyP 的洗脱液按需稀释 1:10 或 1:100，然后按照步骤 4 至 6 所述重新测定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
LB肉汤	Fisher Scientific	BP1427-2	E. coli生长培养基
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP176025
氯化钠 (NaCl)	Fisher Scientific	S27110
氯化镁 (MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
Bradford试剂	Bio-Rad	5000205
Tris缓冲液	Fisher Scientific	BP1525
盐酸 (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	用于调节Tris缓冲溶液的pH
氯化钾 (KCl)	Fisher Scientific	P217500
甘油	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS培养基混合物	Teknova	M2101	E. coli生长培养基
葡萄糖	Fisher Scientific	D161
磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	BP362-500
磷酸氢二钾 (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500
脱水酵母提取物	Fisher Scientific	DF0886-17-0
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421-500
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63-50
一水合硫酸锰	Fisher Scientific	M113-500
异硫氰酸胍	Fisher Scientific	BP221-250
牛血清白蛋白（无蛋白酶）	Fisher Scientific	BP9703100
透明平底96孔板	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	任何透明的96孔板均可使用
Tecan M1000 Infinite酶标仪	Tecan, Inc.	不适用	任何能够测量595 nm和882 nm吸光度的酶标仪均可使用
乙醇	Fisher Scientific	04-355-451
硅胶膜离心柱	Epoch Life Science	1910-050/250
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1.5 mL微量离心管	Fisher Scientific	NC9580154
乙酸铵	Fisher Scientific	A637-500
酒石酸锑钾	Fisher Scientific	AAA1088922
4 N 硫酸 (H₂SO₄)	Fisher Scientific	SA818-500
七钼酸铵	Fisher Scientific	AAA1376630
抗坏血酸	Fisher Scientific	AC401471000