检测经外膜囊泡预处理的巨噬细胞中 Legionella pneumophila 的复制

摘要

来源：Jung, A. L. 等.，《嗜肺军团菌外膜囊泡：分离及其对巨噬细胞促炎潜力的分析》。视频实验杂志（2017）

本视频展示了用嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）外膜囊泡（OMVs）对巨噬细胞进行预处理，以研究其对细菌复制的影响。OMVs通过改变宿主免疫信号通路，使巨噬细胞更易于被感染。与未处理细胞相比，处理细胞中更高的菌落计数表明，OMVs可促进嗜肺军团菌（L. pneumophila）在巨噬细胞内的复制。

方案

1. 巨噬细胞预处理

1. 准备 THP-1（Tohoku Hospital Pediatrics-1 细胞，一种人单核细胞白血病细胞系）细胞。
   注意：THP-1 是源自白血病患者的单核细胞系。
   1. 每 24 孔加入 2×10⁵ 个 THP-1 细胞，并加入 20 nM 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）使其分化为类似巨噬细胞的细胞。在 37 °C 下孵育 24 小时。
   2. 更换为 500 µL 新鲜培养基，再继续孵育 24 小时；THP-1 细胞的最佳培养基为含 10% 胎牛血清的 Roswell Park Memorial Institute 培养基（RPMI）1640 高糖型。
2. 分离小鼠骨髓来源巨噬细胞（mBMDM）。
3. 用外膜囊泡（OMVs）处理 THP-1 来源巨噬细胞或 mBMDM。
   1. 解冻 OMVs，并根据其蛋白含量（0.1、1 和 10 µg/mL）将其加入人或小鼠巨噬细胞中。在 37 °C 下与 OMVs 共同孵育巨噬细胞至少 20 小时。

2. 感染巨噬细胞并通过菌落形成单位（CFU）实验评估细菌复制

1. 使用Legionella pneumophila、步骤4.3中预处理的THP-1细胞或mBMDM，以及未经预处理的巨噬细胞作为对照（2×10⁵/24孔）。不要更换培养基。
2. 用L. pneumophila Corby野生型感染THP-1细胞，用缺乏鞭毛蛋白的L. pneumophila Corby突变株感染mBMDM（感染复数（MOI）均为0.5；每24孔含1×10⁵ L. pneumophila），分别孵育24小时和48小时。
3. 通过加入皂苷（终浓度：0.1%）在培养基中裂解细胞，并在37 °C下孵育5分钟。
4. 用移液器重悬细菌，将悬液转移至反应容器中。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）对含L. pneumophila的培养基进行系列稀释。
5. 取50 µL所需稀释液涂布于缓冲活性炭酵母提取物（BCYE）琼脂平板上，在37 °C下孵育3天。
6. 肉眼计数形成的菌落。计算CFU

将CFU计数结果归一化为未经预处理但被感染的巨噬细胞，后者设为100%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany)	82.1473
活性炭	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)	X865.2
琼脂，Kobe I 型	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)	5210.2
含 5% 绵羊血的哥伦比亚琼脂	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)	254005
硝酸铁九水合物	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)	5632.1
胎牛血清（FCS）	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)	10270-106
Heracell 240i 二氧化碳培养箱	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)	40830469
Heraeus Multifuge X3R 离心机	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)	75004515
接种环	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	由德国柏林罗伯特·科赫研究所（RKI）Antje Flieger 教授惠赠
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	由德国柏林罗伯特·科赫研究所（RKI）Klaus Heuner 教授惠赠
mBMDM	---	---	由德国马尔堡菲利普斯大学 Markus Schnare 教授和德国杜伊斯堡-埃森大学 Carsten Kirschning 教授惠赠
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Germany)	L 1825
佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐（Phorbol 12-myristate 13-acetate）	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)	P8139-1MG
旋转摇床（MaxQ 6000）	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)	SHKE6000
RPMI 1640 高糖培养基	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)	11875-093
皂苷	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)	9622.1
Ultrospec 10 分光光度计	Biochrom Ltd (Cambridge, England)	80-2116-30
THP-1 细胞系	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE 离心机	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
酵母提取物	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)	2363.2