一种细菌收获与机械裂解的操作流程

摘要

来源：Mercier, N., 等 革兰氏阳性菌中MS2亲和纯化与RNA测序联用技术。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了收获细菌细胞并机械裂解以释放其胞内成分的逐步操作流程。

方案

1. 细菌收获

注意：此步骤涉及病原菌的操作。

1. 培养分别携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 或 pCN51-P3-MS2 质粒的菌株单菌落 3 mL 添加红霉素（10）的脑心浸液（BHI）培养基中的质粒 µ克/µL）重复一份。
2. 将每种过夜培养物在50 mL中稀释（≈新鲜BHI培养基的1/100，添加红霉素（10） µ克/µL）以达到 OD_{600 nm} 0.05。使用250 mL的无菌烧瓶（烧瓶与培养基比例为5:1）。
   注意： 培养基和生长条件应根据所研究的小RNA（sRNA）的表达模式来设定。
3. 在37℃培养培养物°37°C、180 rpm 振荡培养6小时。
4. 将每种培养物转移至一个50 mL离心管中。
5. 以 2,900 x 离心 g 4℃下持续15分钟°C. 弃去上清液。
6. 将沉淀物置于冰上，立即进行机械细胞裂解，或将其冷冻并储存在-80℃ °C.

2. 机械细胞裂解

注意：以下步骤必须在冰上进行，缓冲液温度必须为 4 °C。操作时需佩戴手套，并采取所有必要措施防止样本受到 RNase 污染。

1. 将沉淀（步骤 1.6）重悬于 5 mL 缓冲液 A（150 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）中。
2. 将重悬的细胞转移至含有 3.5 g 二氧化硅珠（0.1 mm）的 15 mL 离心管中。
3. 将离心管放入机械细胞裂解仪中，以 4.0 m/s 的速度运行 40 秒。
   注意：如果一次循环不足以裂解细胞，需将仪器冷却 5 分钟，同时将样品置于冰上。然后重复一次 40 秒、4.0 m/s 的循环。可通过将上清液涂布于 BHI 琼脂平板来检测细胞裂解效率。
4. 在 15,700 x g 条件下离心 15 分钟，收集上清液并置于冰上保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Falcon	352070
50 mL 离心管	Falcon	352051
250 mL 培养瓶	Dominique Dutscher	2515074	细菌培养
BHI（脑心浸液）肉汤	Sigma-Aldrich	53286	生长培养基
红霉素（ery）	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	生长培养基
Lysing Matrix B 散装	MP Biomedicals	6540-428	机械裂解
RNAPro 溶液	MP Biomedicals	6055050	机械裂解
FastPrep 仪器	MP Biomedicals	116004500	机械裂解
分光光度计 Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	细菌培养