利用亲和纯化分离小调控RNA结合的细菌靶标RNA

摘要

来源：Mercier, N., et. al., 革兰氏阳性菌中MS2亲和纯化与RNA测序联用技术。 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了利用固定在淀粉树脂上的麦芽糖结合蛋白（MBP）–MS2外壳蛋白融合蛋白，通过亲和纯化方法分离与细菌靶标RNA结合的带有MS2标签的小调节RNA（sRNA）。

方案

缓冲液与培养基

进行MAPS实验时，准备以下缓冲液和培养基：- 缓冲液A（150 mM KCl、20 mM Tris-HCl pH 8、1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）- 缓冲液E（250 mM KCl、20 mM Tris-HCl pH 8、12 mM 麦芽糖、0.1% Triton、1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）

柱制备

注意：切勿让直链淀粉树脂变干。如有需要，可用端盖密封层析柱。在开始亲和纯化前，应提前准备好所有溶液。

1. 将层析柱放入层析柱架中。
2. 移除层析柱的尖端，并用超纯水清洗层析柱。
3. 加入 300 µL 的 amylose 树脂。
4. 用 10 mL 的 Buffer A 清洗层析柱。
5. 将 1,200 pmol 的 MBP（麦芽糖结合蛋白）-MS2 蛋白用 6 mL 的 Buffer A 稀释后上样至层析柱中。
6. 用 10 mL 的 Buffer A 清洗层析柱。

MS2亲和纯化（图1）

1. 将细胞裂解液加入柱中。
   注意： 保留 1 mL 细胞裂解液（粗提物，CE），用于提取总 RNA 并进行 Northern 印迹和转录组分析。
2. 用干净的收集管收集穿流组分（FT）。
3. 用 10 mL 缓冲液 A 洗柱 3 次，收集洗涤组分（W）。
4. 用 1 mL 洗脱缓冲液 E 洗脱柱，并将洗脱组分（E）收集到 2 mL 微量离心管中。
5. 将所有收集的组分置于冰上，直至进行 RNA 提取；或于 -20 °C 冻存以备后续使用。

结果

图1. 适用于Staphylococcus aureus的MAPS方案示意图。从质粒构建到数据分析的全流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
15 mL 离心管	Falcon	352070
2 mL 微量离心管	Starstedt	72.691
250 mL 培养瓶	Dominique Dutscher	2515074	细菌培养
50 mL 离心管	Falcon	352051	培养物离心
淀粉树脂	New England BioLabs	E8021S	MS2 亲和纯化
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP 表达
Poly-Prep 层析柱	BioRad	7311550	MS2 亲和纯化