培养与分离形成荚膜的致病性细菌菌株

摘要

来源：Feltwell, T., 等. 利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了具有不同荚膜产量的细菌菌株的制备与表征方法。携带荚膜相关基因不同突变的致病菌株在液体培养基中培养，并通过离心处理，根据菌体沉淀的密度差异来区分其荚膜表型。采用缓冲液处理以洗涤和稳定细胞，同时保持其荚膜结构的完整性。

方案

1. 细菌菌株或突变文库的制备

1. 将待测菌株划线接种于合适的琼脂平板上。这些平板作为实验的菌种保存平板。

1. 将平板在所需温度下过夜培养，以获得单菌落。本实验中，将肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae，NTUH-K2044 和 ATCC43816 菌株）在 37 °C 条件下接种于 LB 琼脂（Luria 琼脂）培养；将肺炎链球菌（S. pneumoniae，23F 野生型和 23F Δcps）在 37 °C、湿润的烛缸环境中接种于血琼脂培养。

2. 使用无菌接种环或一次性接种针，从保存平板（步骤 1.1）中挑取单个菌落，接种于 10 mL 合适的液体培养基中。若需筛选随机突变体文库，则取 10 μL 随机突变体文库原液（TraDIS 文库）接种至液体培养基中。

1. 在37 °C、低盐LB培养基中振荡培养K. pneumoniae菌株，在37 °C、脑心浸液（BHI）培养基中静置培养S. pneumoniae菌株。

2. 将过夜培养物转移至一个15 mL离心管中，使用台式离心机在3,200 × g条件下离心10分钟，采用带15 mL离心管插件和防气溶胶密封盖的摆动转子。

3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。

注意：上清液应通过实验室适当的液体生物废弃物处理途径进行处置。离心和重悬步骤（1.2.2 和 1.2.3）的目的是浓缩细菌，以便在梯度中易于观察。如需要，细菌培养物可直接上样至梯度。具有厚荚膜的菌株可能无法形成紧密的沉淀。若出现此情况，请尽可能移除上清液，但不得带走任何细菌细胞，然后加入 1× PBS 至终体积为 5 mL，并重悬沉淀。随后继续执行步骤 1.2.5。

5. 按照步骤 1.2.2 中所述方法离心试管。

6. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 2 mL 1× PBS 中。细胞现在即可使用。

注意：细菌细胞悬液的密度并非关键，但需足够浓以在梯度中可见。建议最低 OD₆₀₀（600 nm 处的光密度）为 4。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备 A-4-81 转子和 500 mL 桶的离心机 5810R	Eppendorf	5810 718.007
15 mL 管适配器	Eppendorf	5810 722.004
固定角转子 F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 至 7 mL 管适配器	Eppendorf	5804 739.000
离心机 5424（含转子 FA-45-24-11）	Eppendorf	5424 000.460
2 mL 管	Eppendorf	0030 120.094
1.5 mL 管	Eppendorf	0030 120.086
P1000 移液器及吸头
P200 移液器及吸头