体内检测细菌生物发光与细胞密度的相关性

摘要

来源：Brodl, E., et al. 发光细菌细胞密度与光发射的原位测量及相关性分析. J. Vis. Exp. (2018).

本视频演示了在转化细菌中测量生物发光并将其与细胞密度进行关联的方法。使用单个细菌菌落启动液体培养。将培养物置于微量孔板的孔中，达到所需的细胞浓度。加入抗生素和诱导剂，以表达细菌生物发光所需的基因。利用酶标仪定期读取吸光度和生物发光信号。

方案

1. 设计、制备与表达 lux 操纵子 大肠杆菌

注意：本节所用商业试剂盒的相关信息请参见材料表。

1. 用于转移的 lux 操纵子进入 大肠杆菌 选择一种具有合适限制性酶切位点和目标抗生素抗性基因的标准pET载体（例如pET28a；NcoI，XhoI，卡那霉素）。
2. 根据DNA序列设计用于Gibson组装的片段及重叠引物 Photobacterium mandapamensis 27561（GenBank：DQ988878.2）
3. 使用设计好的引物和分离得到的基因组DNA（脱氧核糖核酸）进行标准的聚合酶链式反应（PCR）扩增 Photobacterium mandapamensis 27561 作为模板。
   注意：分离相应细菌菌株的基因组DNA可提高PCR效率。
4. 通过离心柱纯化法纯化PCR产物。
5. 用 NcoI 和 XhoI 对分离的 pET28a 载体在 37 °C 下进行 45 分钟的限制性酶切消化。
6. 通过琼脂糖凝胶电泳及随后的离心柱纯化，纯化线性化载体和PCR片段。
7. 测定各片段及线性化载体的DNA浓度，并根据实验方案计算连接反应的最佳用量。
   注意组装效率取决于片段大小和数量，需根据制造商的说明书进行调整。
8. 将所有片段与缓冲液加入PCR管中混合后，于PCR仪中50 °C孵育1小时。
9. 根据标准转化方案转化组装好的载体产物 大肠杆菌 将细菌质粒转化至合适的宿主中 E. coli 用于高产量质粒复制的系统（例如， E. coli TOP10 或 XL-1
10. 从转化平板上挑取菌落，并在新的平板上划线以进行DNA分离。
11. 根据标准方案提取质粒DNA。
12. 为验证质粒的正确组装（包括所有片段），首先使用针对每个组装片段的特异性引物，按照标准操作流程进行菌落PCR。
13. 除了菌落PCR及随后的琼脂糖凝胶电泳外，还需将所有分离得到的组装载体进行DNA测序，以验证正确的组装结果和准确的DNA序列。
14. 根据标准的质粒转化方案进行转化 E. coli 将细菌质粒转化至合适的宿主菌中 E. coli 用于高产量蛋白质生产的系统（例如， E. coli BL21
    注意：请继续直接进行下方的表达方案。如需长期保存，建议制备甘油菌种保存液。

2. 修饰型表达 E. coli 菌株

1. 通过将已构建质粒转化的E. coli BL21菌株的甘油保存液（例如100 mL）接种至适量体积的LB（Luria-Bertani）培养基中，制备用于表达的过夜培养物（ONC），或直接从转化平板上挑取单菌落进行接种。加入100 µL卡那霉素（50 mg/mL；pET28a载体的抗生素抗性基因），将ONC置于37 °C、120 rpm条件下，在摇床培养箱中过夜培养。
2. 取8 mL过夜培养物接种至主表达培养液（例如800 mL LB培养基）中，并加入800 µL卡那霉素（50 mg/mL）。
3. 将主培养物置于37 °C、120 rpm的摇床培养箱中培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.6–0.8（约需2.5小时）。
4. 将培养温度降至28 °C。
5. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（propyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG），使其终浓度为0.1 mM，以诱导蛋白表达。
   注意：经验性测试表明，将培养温度降至28 °C时发光强度最高。
6. 持续观察菌体，直至其开始发光（约1小时后）。
   注意：根据表达目的，可继续培养菌体至次日再进行收集，也可在菌体持续发光期间保持振荡培养（最长48小时）。细胞的收集及目标蛋白的纯化可按照标准操作流程进行。

3. 细菌生物发光菌株的表达

注意：细菌发光菌株需要特定的培养基/人工海水培养基以供生长和发光。

1. 准备由两种分别配制的培养基成分组成的人工海水培养基。​
   注意：以下用量适用于1 L液体培养基或1 L琼脂培养基。
   1. 配制人工海水培养基时，称取以下盐类：28.13 g NaCl（氯化钠）、0.77 g KCl（氯化钾）、1.60 g CaCl₂ · 2H₂O（二水合氯化钙）、4.80 g MgCl₂ · 6H₂O（六水合氯化镁）、0.11 g NaHCO₃ （碳酸氢钠）和3.50 g MgSO₄ · 7H₂O（七水合硫酸镁）。
   2. 加入1 L蒸馏水，溶解所有组分。
   3. 配制LB培养基时，称取以下成分：10 g酵母提取物、10 g蛋白胨；若制备琼脂平板，则额外加入20 g琼脂。
   4. 加入250 mL自来水，溶解各组分。
   5. 将上述两种培养基分别在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
   6. 制备琼脂平板时，在高压灭菌后立即混合250 mL LB培养基与750 mL人工海水培养基，并倒板。
   7. 配制液体培养基时，可在高压灭菌后立即或冷却后，将250 mL LB培养基与750 mL人工海水培养基混合。
      注意：人工海水培养基可能因盐类析出而变得浑浊。
2. 将发光细菌菌株划线接种于人工海水培养基琼脂平板上，在24–30 °C条件下过夜培养。
   注意：细菌菌株的长期保存通常通过冷冻保存含甘油的菌种实现。由于解冻后细菌生长存在延滞期，因此在用于液体培养前，应先将菌株划线接种至琼脂平板，以确保所有菌株起始状态一致。
3. 取平板上的单菌落接种至100 mL人工海水培养基中，制备过夜培养物（ONC）。将ONC置于24–30 °C、120 rpm的摇床中过夜培养。
4. 用8 mL ONC接种800 mL人工海水培养基。
5. 将细菌培养物置于24–30 °C、120 rpm的摇床中培养。
   注意：发光细菌的发光强度随温度变化显著。根据特定菌株发光调控机制的不同，发光通常在接种后约1–6小时开始。
6. 观察细菌培养物，直至其开始发光（约1–6小时）。
   注意：根据实验目的，可继续培养至次日收获细胞，或持续摇菌直至发光停止。细胞收获及蛋白纯化可按照标准操作流程进行。

4. 体内细菌生物发光菌株及改造后E. coli菌株活性检测

注意：菌株的长期保存通常通过冷冻保存细菌培养物的甘油菌种实现。由于解冻后存在生长迟缓期，在用于液体培养之前，应始终先将菌株划线接种于琼脂平板上，以确保所有菌株具有均一的起始培养条件。

1. 将目标发光细菌菌株或改造后的 E. coli 菌株划线接种于琼脂平板上，在 28 °C 条件下过夜培养。
   注意：不同菌株的培养温度可能有所不同，需通过实验经验确定。为能够比较不同发光细菌菌株及改造 E. coli 菌株，必须保持一致的培养条件。
2. 从琼脂平板上挑取单菌落，接种至 3 mL 培养基中，并在 28 °C、180 rpm 条件下于摇床中培养约 1 - 2 小时。
3. 测定液体培养物 1:10 稀释液在 650 nm 处的细胞密度。计算获得 OD650 为 0.05 的 1 mL 培养液所需的菌液比例与体积。
   注意：后续的酶标仪检测将在 650 nm 处测定细胞密度，以避免菌株发光对检测信号的干扰。
4. 将计算所得体积的菌液与培养基加入底部为玻璃的 24 孔黑壁板中。对于改造的 E. coli 菌株，向样品中加入 1 µL 卡那霉素（pET28a 载体的抗生素抗性）和 1 µL IPTG（诱导基因表达）。盖上盖子，以防止测量过程中液体蒸发。
   注意：为确保含有完整 lux 操纵子的 pET28a 载体不会在 E. coli 培养过程中丢失，必须在每孔 E. coli 样品中添加卡那霉素；同时，为确保能够检测到 E. coli 细胞的发光，必须使用 IPTG 诱导基因表达。为避免串扰和检测干扰，推荐使用黑壁、玻璃底且带透明盖的孔板，其检测效果最佳。尽管如此，仍可能存在串扰现象，因此需谨慎选择孔位布局。
5. 在酶标仪中开始检测。
   注意：酶标仪检测程序基于为此实验专门开发的脚本，可同时进行吸光度和生物发光两项检测。每 10 分钟采集一次数据，检测间期持续振荡，并保持 28 °C 恒温。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒	New England Biolabs Inc.	E2621S	适用于 10 次反应 dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion 聚合酶	Thermo Scientific	F530S
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet 基因组 DNA 纯化试剂盒	Thermo Scientific	K0721	适用于 50 次反应
限制性内切酶及缓冲液（NcoI, XhoI）	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV 凝胶和 PCR 产物纯化试剂盒	Promega	A9282	适用于 250 次反应
Monarch DNA 凝胶回收试剂盒	New England Biolabs Inc.	#T1020S	适用于 50 次反应
GeneJet 质粒小量提取试剂盒	Thermo Scientific	K0503	适用于 250 次反应
GoTaq G2 DNA 聚合酶	Promega	M7841
24 孔黑色 sensoplate 培养板，带玻璃底	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega 酶标仪	BMG Labtech
OPTIMA/Mars 分析软件	BMG Labtech		版本 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard 恒温振荡培养箱	Infors AG