培养Magnetospirillum细菌及其趋磁行为的评估

摘要

来源： Le Nagard, L., et al. 培养磁螺菌属（Magnetospirillum）磁性趋磁细菌：菌株MSR-1、AMB-1和MS-1。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了如何在微需氧条件下使用液体和半固体培养基培养磁螺旋菌。重点展示了在有氧-无氧界面处形成可见的细菌带，以及随着氧气消耗，细菌带向上迁移的现象。视频还展示了如何通过观察细菌在磁场作用下的定向游动来评估其趋磁行为。

方案

1. 趋磁细菌（MTB）的接种

注意： AMB-1、MS-1 和 MSR-1 菌株的培养物可从商业途径获得（材料表）。

注意：所有以下步骤均须在无菌条件下，于本生灯火焰旁进行。

1. 在液体培养基中接种菌株MSR-1、AMB-1和MS-1
   1. 用丁基橡胶塞和铝制压盖密封一个空的125 mL血清瓶。通过橡胶塞插入两根针头，并将一个注射器连接到其中一根针头上。通过与N₂工作站所用相同的管路，将注射器连接至O₂气瓶。
   2. 让O₂气体流经该瓶约30分钟，以确保瓶内所有空气均被O₂取代。随后拔出两根针头，使瓶内保持轻微正压，然后进行高压灭菌。使用前让瓶子冷却至室温。
      注意：为节省时间，可在培养基制备过程中同步执行步骤1.1.1和1.1.2，并将瓶子与培养基或储备液一同灭菌。
   3. 用移液器滴加数滴70%乙醇溶液至新鲜培养基瓶和O₂瓶的橡胶塞顶部，并将其通过本生灯火焰，以对瓶塞表面进行灭菌。
   4. 使用无菌注射器和针头，从O₂瓶中抽取1 mL O₂气体，并转移至新鲜培养基瓶中。此过程中应确保针头与注射器紧密连接，避免注射器内混入空气。
   5. 若接种物来自玻璃瓶中培养的其他培养物，请用移液器滴加数滴70%乙醇溶液至新鲜培养基瓶和旧培养物瓶的橡胶塞顶部，并将其通过本生灯火焰进行灭菌。若接种物来自冷冻菌种管，则只需在本生灯火焰下保持密封状态，使其自然升温至室温即可。
   6. 若接种物来自玻璃瓶中培养的其他培养物，取1 mL旧培养物接种至新鲜培养基中。若使用冷冻保存的菌种作为接种物，则仅接种0.1 mL，以稀释冷冻过程中所用的甘油或二甲基亚砜（DMSO）。两种情况下均需使用无菌针头和无菌注射器。
   7. 将培养物在32 °C条件下培养，并在4至7天后转接至新鲜培养基中。
2. 在O₂浓度梯度半固体培养基中接种MSR-1
   1. 确认新鲜培养基试管中存在清晰定义的有氧-无氧界面（OAI），该界面表现为由粉红色向无色过渡的分界线。
   2. 若接种物来自另一具有O₂浓度梯度的半固体培养物，使用无菌移液器吸头吸取位于细菌带处的50 µL培养物进行收集。将这些细菌缓慢接种至新鲜培养基的OAI位置（即粉红色/无色界面处），注意避免扰动界面。若接种物来自冷冻菌种，则改用100 µL接种物，其余操作相同。
   3. 密封试管，并在25 °C至30 °C之间培养细菌。在细菌带到达培养基表面之前，采用相同方法将其转接至新鲜培养基中。

2. 细菌的观察

1. 用70%乙醇溶液擦拭培养瓶的瓶塞顶部，并通过本生灯火焰进行灭菌。对于半固体培养基，应在本生灯火焰下方打开试管。使用无菌接种针和无菌注射器吸取细菌。
2. 采用悬滴法8检测，以确认细菌具有磁性且具备运动能力。
   注意：相差显微镜可获得良好效果，但并非必需。10X至60X的放大倍数均适用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AMB-1	美国模式培养物集存库 (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	德国微生物及细胞培养物保藏中心 (DSMZ)	DSM 6361
L-半胱氨酸·盐酸·一水合物 (L-cysteine.HCl.H₂O)	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1.0 mL 注射器	Fischer Scientific	B309659
25G × 1 针头	BD	305125
125 mL 血清瓶	Wheaton	223748
20 mm 铝制密封盖	Wheaton	224223-01
20 mm E-Z 压盖器	Wheaton	W225303
丁基橡胶塞	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Hungate 管	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
隔垫塞，13 mm，Hungate 型	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
玻璃培养管	Corning (VWR)	9826-16X