一种用于革兰氏阳性菌抗生素敏感性检测的肉汤微量稀释法

摘要

来源： Koeth, L. M., 等人达巴万星的参考肉汤微量稀释法 在 体外 需氧生长细菌的药敏试验 视频实验期刊. (2015).

本视频演示了采用肉汤微量稀释法测定脂糖肽类抗生素对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（MIC）的方法。内容包括细菌菌落的分离、稀释、接种含有不同抗生素浓度的微孔板孔位，以及培养物纯度和细胞计数的验证。视频还解释了抗生素结合如何干扰细胞壁合成，导致细胞裂解，以及如何根据可见的生长抑制现象确定最小抑菌浓度（MIC）。

方案

1. 准备 MIC 板稀释液

1. 在无菌玻璃或塑料管中，用纯二甲基亚砜（DMSO）配制浓度不超过 1,600 μg/mL 的达巴万星储备液。该溶液应在配制当天使用，或储存于 -20 至 -60 °C 或更低温度的无霜冰箱中以备后续使用。称量粉末时，应参考随粉末提供的文件中标注的达巴万星效价。
2. 使用纯 DMSO 在无菌玻璃或塑料管中按类似方案进行储备液的稀释。使用一支移液器量取稀释液，另一支移液器将初始达巴万星储备液加入第一支试管中。每种后续的达巴万星储备浓度均应使用新的移液器。
3. 用纯 DMSO 配制最终 MIC 板浓度的 100 倍中间浓度稀释液。将适量的原液与 DMSO 混合，以获得所需的中间浓度（所用体积取决于需制备的 MIC 板数量）。
4. 配制 0.004% P80：通过将 0.1 mL P80 加入 4.9 mL dH₂O 中，新鲜配制 2% P80 工作储备液。经 0.22 μm 滤膜过滤除菌后，于配制当日使用。通过将 2% P80 进行 1:500 稀释（例如，将 0.3 mL 2% P80 加入 149.7 mL CAMHB 中），配制 0.004% P80 稀释液。
5. 进一步将中间浓度用补充了 0.004% (v/v) 吐温-80（P-80）和/或 LHB（用于链球菌）的阳离子调节 Mueller Hinton 肉汤（CAMHB）进行 1:100 稀释，上述添加剂应加入双倍终浓度，因为接种物的加入会导致 1:2 的稀释。

2. 准备 MIC 板

1. 将配制好的每种达巴万星溶液各取 50 μL，加入 MIC 板的相应孔中，并留出一个孔只加培养基（作为生长对照孔）。此步骤可使用带无菌吸头的多通道移液器操作。
2. 立即使用 MIC 板，或用塑料封膜密封后放入塑料袋中，并立即置于 ≤ -20 °C（最好 ≤ -60 °C）的无霜冰箱中冷冻保存，待需要时再使用。若使用冷冻的 MIC 板，使用前应去除密封膜，将单个 MIC 板置于实验台上静置 15–30 分钟（直至孔内液体完全解冻），然后再进行接种操作。

3. 接种 MIC 板、进行纯度检测并设置菌落计数

1. 从培养18–24 小时的血琼脂平板或其他非选择性琼脂平板上，挑选数个分离良好的菌落。用无菌接种环或拭子接触每个菌落顶部，转移至1–5 mL CAMHB或生理盐水，直至菌液浊度相当于0.5麦氏标准。通过与0.5麦氏标准进行目视比较或使用光度计设备评估浊度。
2. 制备后15–30 分钟内，将接种物在CAMHB中按1:100稀释（100 μL加入10 mL CAMHB）。对于大多数测试的细菌（肺炎链球菌 S. pneumoniae 除外），此稀释度可使每孔终浓度达到5 × 10⁵ CFU/mL（可接受范围为2–8 × 10⁵ CFU/mL）。对于 S. pneumoniae，根据浊度与0.5麦氏标准比较所得的细菌浓度通常显著较低，因此应将接种物按1:25稀释（400 μL加入10 mL CAMHB + 10% LHB）。
3. 接种物制备后15 分钟内，将50 μL最终接种物转移至MIC板条的每一孔中（除无菌对照孔外）。此步骤可使用多通道移液器配合无菌吸头完成。
4. 通过无菌接种环取阳性生长对照孔中的1–10 μL样品，转移并涂布于非选择性琼脂平板（如含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂），进行纯度检查。
5. 使用单通道移液器和无菌吸头，从生长对照孔中取出10 μL样品，转移至10 mL生理盐水中（1:1,000稀释），混匀后，再用单通道移液器和无菌吸头取100 μL转移至合适的非选择性琼脂培养基（如含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂），用无菌接种环在整个琼脂表面均匀涂布，不同方向重复涂布两次，以确保接种物均匀分布（1:10稀释）。

4. 孵育 MIC 板、菌落计数及纯度平板

1. 将每个 MIC 板或不超过四个板的堆叠用塑料胶带或紧密贴合的塑料盖密封在塑料袋中，然后进行孵育。或者，将一个空的 MIC 板放在不超过 4 个 MIC 板的堆叠顶部，将一张湿润的纸巾放入塑料容器中，将 MIC 板放入该塑料容器内，并用盖子牢固封闭容器。接种后 30 分钟内，将 MIC 板置于 35 °C ± 2 °C 的常温空气孵育箱中孵育 16–20 小时（用于葡萄球菌和肠球菌）或 20–24 小时（用于链球菌）。菌落计数和纯度平板在相同条件下孵育，但链球菌需置于含 5% CO₂ 的孵育箱中孵育。

5. 读取 MIC 和菌落计数平板；检查纯度平板

1. 通过肉眼观察，将 MIC 读取为完全抑制孔中细菌生长的最低浓度。
2. 计数平板上的菌落数量。将每个菌落乘以稀释倍数（1:10,000）（例如，50 个菌落相当于 5 × 10⁵ CFU/mL）。可接受范围为 20–80 个菌落（2–8 × 10⁵ CFU/mL），可作为大致参考标准。
3. 检查纯度平板。如果所有菌落均与彼此相似，则可认为接种物是纯的。如果存在其他类型的菌落，则 MIC 检测板中可能存在污染，应重复试验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
达巴万星	Metrics, Inc.	美国北卡罗来纳州格林维尔	BI-397
万古霉素	Sigma-Aldrich	美国密苏里州圣路易斯	C5793
阳离子调节穆勒-欣顿肉汤	Becton Dickinson	美国马里兰州斯帕克斯	212322
溶血液马血	Cleveland Scientific	美国俄亥俄州巴思
Dose-it 蠕动泵	Integra Biosciences	美国新罕布什尔州哈德逊
多通道移液器（Viaflo II）	Integra	美国新罕布什尔州哈德逊	4164
12通道移液器（Matrix）	ThermoFisher Scientific	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
单通道移液器（Ovation 10 µL - 100 µL）	VistaLab	美国纽约州布鲁斯特
96孔微孔板	Greiner Bio-one	美国北卡罗来纳州门罗	650161
50 mL 平盖锥底离心管	ThermoFisher Scientific	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
16x125mm 一次性玻璃试管	ThermoFisher Scientific	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
12x17mm 扣盖聚苯乙烯管	ThermoFisher Scientific	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
16 mL 离心管	BioExpress	美国犹他州凯斯维尔	C-3394-2
试剂储液槽	Integra Biosciences	美国新罕布什尔州哈德逊	4312
一次性无菌接种环（1 µL 和 10 µL）	Biologix	美国堪萨斯州利奈克萨	65-0001,65-0010
胰蛋白酶大豆琼脂 + 5% 绵羊血	Becton Dickinson	美国马里兰州斯帕克斯
常温培养箱	Sanyo
5% CO₂ 培养箱	Sanyo
分析天平	ThermoFisher Scientific	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
手套	Kimberly-Clark		52817
实验服