一种用于革兰氏阳性菌抗生素敏感性试验的肉汤微量稀释法

摘要

资料来源：Koeth， LM 等人，有氧生长细菌的达巴万星体外敏感性测试的参考肉汤微量稀释方法。J. Vis. Exp.（2015）。

该视频演示了用于确定脂糖肽抗生素对革兰氏阳性菌的最小抑制浓度 （MIC） 的肉汤微量稀释方法。它涵盖细菌菌落分离、稀释、接种不同抗生素浓度的微孔板孔以及培养纯度和细胞计数的验证。该视频还解释了抗生素结合如何破坏细胞壁合成，导致裂解，以及如何根据可见的生长抑制来识别 MIC。

方案

1. 制备 MIC 面板稀释液

在

1. 无菌玻璃或塑料管中的纯（纯）二甲基亚砜 （DMSO） 中制备不高于 1,600 μg/mL 的达巴万青储备溶液，并在制备当天使用或储存在 -20 至 -60 °C 或以下，以备将来在非除霜冰箱中使用。称量粉末时，请考虑随粉末一起收到的文件中提供的达巴万青的效力。
在
2. 无菌玻璃或塑料管中用纯 DMSO 稀释原液稀释液，类似于方案。使用一个移液器测量稀释剂，使用另一个移液器将初始达巴万星储备液添加到第一个试管中。对于每个后续的达巴万青储备浓度，请使用新的移液器。
3. 用纯 DMSO 制备 100 倍最终 MIC 面板浓度稀释液（中间浓度）。将适当体积的源和DMSO组合在一起，以达到所需的中间浓度（使用的体积将取决于要制作的MIC面板的数量）。
4. 制备 0.004% P80：通过将 0.1 mL P80 添加到 4.9 mL dH₂O 中制备 2% P80 的新鲜工作储备溶液。通过 0.22 μm 过滤器进行灭菌，并在制备当天使用该溶液。通过将 2% P80 以 1：500 稀释（例如，0.3 mL 2% P80 至 149.7 mL CAMHB）来制备 0.004% P80 稀释剂。
5. 此外，在阳离子调整的Mueller Hinton肉汤（CAMHB）中以1：100稀释中间浓度，该肉汤补充了0.004%（v / v）聚山梨醇酯-80（P-80）和/或LHB（用于链球菌），以终浓度的两倍添加，因为添加接种物将导致1：2的稀释。

2. 准备 MIC 面板：

将

1. 50 μL 制备的每种白巴万青素溶液分配到 MIC 面板的适当孔中，并仅将培养基包含在一个孔中（生长对照孔）。此步骤可以使用带有无菌吸头的多通道移液器。
2. 立即使用面板或用塑料薄膜密封，放入塑料袋中，立即放入 ≤ -20 °C（最好是 ≤ -60 °C）的非解冻冰箱中，直到需要为止。如果使用冷冻面板，请取下密封件并将单个面板放在实验室工作台上 15-30 分钟（直到孔内容物解冻），然后再进行面板接种。

3. 接种 MIC 面板，进行纯度并设置菌落计数

从

1. 18-24 小时血琼脂或其他非选择性琼脂平板中选择几个分离良好的菌落。用无菌环或拭子接触每个菌落的顶部，然后转移到 1-5 mL CAMHB 或盐水中，直到浊度相当于 0.5 McFarland 标准。通过与 0.5 McFarland 或光度测量设备进行目视比较来评估浊度。
在
2. 制备后 15-30 分钟内，在 CAMHB 中以 1：100 的比例稀释接种物（100 μL 至 10 mL CAMHB）。对于大多数针对达巴万星进行测试的细菌，肺炎链球菌除外，这种稀释液将提供 5 × 10⁵ CFU/mL 的最终孔浓度（可接受范围为 2-8 × 10⁵ CFU/mL）。对于肺炎链球菌，基于浊度与 0.5 McFarland 的比较的细菌浓度通常要低得多。因此，将接种物以 1：25 稀释（400 μL 至 10 mL CAMHB + 10% LHB）。
在
3. 接种物制备后 15 分钟内，将 50 μL 最终接种物转移到制备的 MIC 面板的每个孔（无菌对照孔除外）。此步骤可以使用使用无菌吸头的多通道移液器。
通过
4. 使用无菌环将 1-10 μL 等分试样从阳性生长对照孔转移并铺展到非选择性琼脂（例如，含有 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂）来进行纯度检查。
通过
5. 使用单通道移液器和无菌吸头从生长对照孔中取出 10 μL 并转移到 10 mL 生理盐水（1：1,000 稀释度）中来建立菌落计数。用单通道移液器和无菌吸头混合并转移 100 μL 到合适的非选择性琼脂培养基（例如，含有 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂）中，并用无菌环铺布在整个琼脂表面，在不同方向上重复两次以确保接种物的均匀分布（1：10 稀释）。

4. 孵育 MIC 面板、菌落计数和纯度板

1. 在孵育前，用塑料胶带或紧密贴合的塑料盖将每个 MIC 面板或不超过四个面板的堆叠密封在塑料袋中。或者，将一个空的 MIC 面板放在不超过 4 个 MIC 面板的堆栈顶部，将湿纸巾放入塑料容器中，将 MIC 面板放入塑料容器中，并用盖子牢固地关闭容器。在接种后 30 分钟内，将 MIC 面板在 35 °C ± 2 °C 的环境空气培养箱中孵育 16-20 小时（葡萄球菌和肠球菌）和 20-24 小时（链球菌）。在相同条件下孵育菌落计数和纯度板，但链球菌在5%CO₂培养箱中孵育除外。

5. 读取 MIC 和菌落计数板;检查纯度板

读取

1. MIC 作为肉眼检测到的完全抑制孔中细菌生长的最低浓度。
在
2. 菌落计数板上计数菌落。将每个菌落乘以稀释因子 （1：10,000）（例如，50 个菌落相当于 5 × 10⁵ CFU/mL）。可接受的范围是 20-80 个菌落（2-8 × 10⁵ CFU/mL），用作近似指南。
3. 检查纯度板。如果所有菌落都与每个菌落相似，则可以认为接种物是纯的。如果存在任何其他菌落，则 MIC 面板中可能存在污染物，应重复测试。

材料