纳米颗粒介导的细菌感染细胞中内体-溶酶体系统重塑的可视化研究

摘要

来源：Zhang, Y., 等. 荧光纳米颗粒在研究胞内细菌介导的内体-溶酶体系统重塑中的应用. J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用荧光纳米颗粒可视化人上皮细胞在胞内细菌感染后发生的内体-溶酶体系统重塑过程。细菌入侵后，病原体会操控宿主细胞骨架和内体-溶酶体系统，形成带有管状突起的空泡，从而改变囊泡运输。随后使用荧光标记的纳米颗粒追踪这些变化，实现对病原体诱导的细胞内运输事件的高分辨率成像。

方案

1. HeLa 细胞的培养
   1. 稳定表达LAMP1-GFP（溶酶体相关膜糖蛋白1-绿色荧光蛋白）的HeLa细胞在含10%胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，并于37 °C、5% CO₂气氛条件下孵育。₂.
   2. 以每孔50,000个的密度将细胞接种于8孔细胞培养载玻片（Ibidi）中，过夜培养（O/N）。
2. 细菌培养
   1. 使用 肠炎沙门氏菌 血清型 鼠伤寒沙门菌 NCTC 12023 野生型（WT）菌株。作为对照，使用突变菌株 ΔssaV SPI2-T3SS 缺陷型及 ΔsifA 缺乏形成SIF的关键效应蛋白SifA。使用含有质粒pFPV25.1的菌株以实现增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的组成型表达。
      注意： 细菌菌株常规培养于添加50 µg/ml羧苄青霉素的Luria-Bertani培养基（LB）中（WT），以及添加50 µg/ml羧苄青霉素和/或50 µg/ml卡那霉素的LB培养基中（Δ）ssaV，ΔsifA) 维持质粒所需。
   2. 接种单个细菌菌落于3 ml含有适当抗生素的LB培养基中，37 ºC振荡培养过夜以实现通气，随后用新鲜LB培养基按1:31比例稀释，并继续培养3.5小时。此时，菌液达到对数生长后期，细菌具有高度侵袭性。使用“滚筒摇床”可方便地对试管培养物进行通气培养。
3. HeLa细胞的感染 沙门氏菌 以及金-BSA-罗丹明纳米颗粒（或NPs）脉冲-追踪标记（示意图见图1）
   1. 测量OD₆₀₀ 的继代培养细菌，并稀释至OD₆₀₀ = 0.2，溶于1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中（约3 × 10⁸ cfu/ml），向8孔腔室载玻片中的HeLa细胞加入适量细菌，以达到100的感染复数（MOI）。
   2. 在细胞培养箱中孵育30分钟，用PBS洗涤3次以去除未被内化的细菌（此时间点定义为感染后0小时，即0 h p.i.）。加入300 µl含100 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，继续培养1小时。随后更换为含10 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，并在后续孵育期间维持该浓度。
   3. 孵育1小时后（培养基含100 µg/ml庆大霉素），弃去原培养基，更换为成像培养基（不含FCS、L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠的Eagle's MEM，含30 mM HEPES，pH 7.4），其中添加10 µg/ml庆大霉素。将金-BSA-罗丹明纳米颗粒加入HeLa细胞中，使其终浓度达到OD₅₂₀ = 0.1。（牛血清白蛋白，或 BSA）
      注意： 金-BSA-罗丹明纳米颗粒也可在感染前或感染后不同时间点加入细胞中。
   4. 孵育1小时后，移除培养基，用PBS洗涤3次，然后加入300 µl新鲜成像培养基（含10% FCS和10 µg/ml庆大霉素），继续孵育至预定时间。
      注意： 孵育时间可能因所用纳米颗粒（NPs）的浓度和细胞系的不同而有所差异。对于RAW264.7巨噬细胞，我们观察到在OD浓度下与NPs孵育30分钟即可达到预期效果。₅₂₀ = 0.05 时足以实现充分的内化。

结果

图1. 活细胞成像用HeLa细胞的制备流程图 HeLa 细胞接种于培养皿腔室中，进行模拟感染或接种不同病毒 沙门氏菌 孵育30分钟，用PBS洗涤3次，然后在含有100 µg/ml庆大霉素的培养基中孵育1小时。随后，更换为含有10 nm金-BSA-罗丹明纳米颗粒（OD₅₂₀ = 0.1）和10...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化金	Sigma-Aldrich	520918
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
NHS-罗丹明	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
庆大霉素	Applichem	A1492
卡那霉素	Roth	T832
羧苄青霉素	Roth	6344
8孔培养皿载玻片	Ibidi	80826	组织培养处理，无菌