在铁限制条件下培养结核分枝杆菌

摘要

来源：Gupta, S., et al. 铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离与表征. J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了培养的步骤 结核分枝杆菌 在铁限制条件下培养，以诱导铁胁迫并促进细菌分泌支持其存活的铁载体。

方案

1. 分枝杆菌的培养 在铁限制条件下

1. 解冻 50 µL 冷冻的含 15% 甘油的 Mtb 菌种结核分枝杆菌 接种于添加10% ADN（白蛋白-葡萄糖-氯化钠）增补剂（含5 g/L白蛋白、2 g/L葡萄糖、0.85 g/L氯化钠、0.2%甘油和0.05% Tween-80）的琼脂平板，并进行划线分离。将平板置于37 °C培养至菌落可见。
2. 接种一株结核分枝杆菌单菌落于2 mL分枝杆菌液体培养基中（材料表加入ADN富集物，在37 °C下振荡培养。
3. 让结核分枝杆菌培养物生长至对数期末期（OD₅₄₀ 约为0.8）。为验证此值，测量OD₅₄₀ 使用分光光度计。
4. 将200 µL对数生长后期的菌液均匀涂布于分枝杆菌琼脂平板上（材料列表) 加入0.2%甘油、0.05%吐温-80和ADN。至少接种5个平板。37 °C培养，直至细菌生长形成可见的融合菌层。结核分枝杆菌（Mtb）约需1周时间。
5. 用无菌棉签蘸取低铁最低培养基（LIMM），用该棉签从琼脂平板上采集细菌，并接种至100 mL LIMM中，制备浓度较高的细菌悬液，其OD₅₄₀ 约1.0。
6. 用LIMM将该悬浮液稀释10倍至1 L，然后分装到两个2 L的无菌塑料瓶中，每瓶含500 mL培养液。
7. 取出 2 mL 培养物，转移至 5 mL 培养管中。加入 10 µL 10% vol/vol 的 tyloxapol。
8. 在37 °C下培养培养物14天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Middlebrook 7H10 琼脂	BD Difco	262710	分枝杆菌琼脂平板
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Difco	271310	分枝杆菌液体培养基
聚丙烯薄壁离心管 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	聚丙烯薄壁离心管 13x15 mm
真空过滤瓶	CellPro	V50022	过滤装置