从Mycobacterium tuberculosis中分离含铁载体的细胞外囊泡

摘要

来源：Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 铁限制条件下分枝杆菌产生细胞外囊泡的分离与表征。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了从在模拟宿主环境的限铁条件下培养的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中逐步分离胞外囊泡（EVs）的方法。该方法概述了如何利用超滤、差速离心和密度梯度分离技术来富集并鉴定含有EVs的组分。

方案

1. 分枝杆菌胞外囊泡（MEVs）的收集

1. 在收集时测定2 mL培养物在OD₅₄₀处的吸光度。将培养物进行1:10连续稀释，取每种稀释液100 µL，接种于含有ADN和0.05% Tween-80的琼脂平板上。
2. 将培养物转移至五个225 mL锥形离心管中，在20 °C下以2,850 × g离心7分钟。
3. 用50 mL移液管收集培养上清液，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。

2. MEVs 的分离

1. 将培养滤液转移至置于 4 °C 的搅拌式超滤系统中，并对浓缩液进行过滤 <50 psi 压力下通过 100 kDa 截留分子量膜浓缩至约 50 mL。
2. 将浓缩的培养滤液在15,000 x g 在 4 °C 下离心 15 分钟，收集上清液。
3. 将培养滤液置于聚碳酸酯超速离心管中，在100,000 x g条件下离心 g 4 °C 下孵育 2 小时。
4. 用移液器轻轻吹打，将膜状沉淀重悬于总体积为1 mL的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
5. 将步骤2.4中获得的沉淀悬浮液0.5 mL与1.5 mL 60%碘克沙醇溶液混合，得到终浓度为45%（wt/vol）的碘克沙醇溶液。将该混合液加入13 mm × 51 mm聚丙烯薄壁超速离心管底部。
6. 在 MEV-碘克沙醇 45% 悬液上依次覆盖 1 mL 的 40%、35%、30%、25% 和 20%（体积比，溶于 PBS）碘克沙醇溶液，并在最上层加入 1 mL PBS。
7. 在 100,000 × g 条件下离心 g 4 °C 条件下孵育 18 小时。
8. 使用1 mL Hamilton注射器从顶部开始收集1 mL密度梯度组分。
9. 用 PBS 将每份收集的组分稀释至 20 mL，然后在 100,000 x g 4 °C下孵育2小时。
10. 移除上清液，将沉淀重悬于 0.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C 保存该沉淀。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon 搅拌式超滤池 Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	超滤系统
BD 聚丙烯 225 ml 圆锥形离心管	Fisher	05-538-61	圆锥形离心管
Biomax 100-kDa 截留分子量超滤膜	EMD Milipore	PBHK07610	超滤膜
Optiprep	Sigma	D1556	碘克沙醇
聚碳酸酯超速离心管 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	聚碳酸酯超速离心管 25 x 89 mm
聚丙烯薄壁离心管 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	聚丙烯薄壁离心管 13x15 mm
真空过滤瓶	CellPro	V50022	过滤装置