从结核分枝杆菌中分离出含铁载体的细胞外囊泡

摘要

资料来源： Gupta， S.， Marcela Rodriguez， G. 铁限制分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离和表征。 J. Vis. Exp. （2019年）

该视频演示了从模拟宿主环境的铁限制条件下培养的 结核分枝 杆菌中逐步分离细胞外囊泡 （EV）。它概述了使用超滤、差移离心和密度梯度分离来富集和鉴定含 EV 的馏分。

方案

1. 分枝杆菌细胞外囊泡 （MEV） 的收集

1. 在收集时测量 2 mL 培养物的 OD₅₄₀ 。将培养物进行1：10的连续稀释，并将每种稀释液的100μL接种在琼脂平板上，含ADN和0.05%吐温-80。
2. 将培养物转移到五个 225 mL 锥形离心管中，并在 20 °C 下以 2,850 x g 离心 7 分钟。
3. 用50mL移液器收集培养上清液，并通过0.22μm过滤装置进行过滤灭菌。

2. MEV 的隔离

1. 将培养滤液转移到置于 4 °C 的搅拌细胞超滤系统中，并通过 100 kDa 截止膜在 <50 psi 下过滤浓缩物至 ~50 mL。
2. 将浓缩培养滤液在4°C下以15,000× g 离心15分钟，并收集上清液。
3. 在聚碳酸酯超速离心管中以100,000 x g 离心培养滤液，在4°C下离心2小时。
4. 通过轻轻移液将膜沉淀重悬于总共 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
5. 将步骤2.4中获得的0.5mL沉淀悬浮液与1.5mL 60%碘沙醇溶液混合，得到45%wt / vol的最终碘醇浓度。将这种混合物分配在 13 mm x 51 mm 聚丙烯薄壁超速离心管的底部。
6. 在MEV-碘沙醇45%悬浮液上覆盖1mL的40%、35%、30%、25%和20%（PBS中的体积/....

材料