从细菌中分离和富集外膜来源的细胞外囊泡

摘要

资料来源： 沃森特区， et.al。从大肠杆菌和其他细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡。 J. Vis. Exp. （2021年）

该视频演示了源自基因工程细菌外膜的细胞外囊泡 （EV） 的分离和浓缩。该过程包括培养细菌以释放 EV，然后进行顺序离心和过滤步骤以去除细胞和碎片。最后，超滤用于浓缩EV以进行下游分析。

方案

1. 细菌菌株和培养条件

注意： 本研究中使用的细菌菌株是 大肠杆菌 MP1、 嗜粘液阿克曼氏菌、拟 杆菌 thetaiotaomicron、 短双歧杆菌和 齿双歧杆菌。

1.对于 大肠杆菌，使用无菌环将单个菌落接种到250至1,000mL的Luria-Bertani（LB）肉汤中，并在处理培养物之前在300rpm和37°C的摇动培养箱中有氧孵育48小时。对于含有p114-mCherryClyluc的重组 大肠杆菌 MP1菌株，将氯霉素加入LB琼脂和肉汤中，终浓度为17μg/mL。

2. 对于 嗜粘液杆菌、T . thetaiotaomicron、 B. breve 和 B. dentium，在脑心输液 （BHI） 琼脂平板上划线，并在乙烯基厌氧室内厌氧孵育。将单个菌落接种到100mL预还原的BHI肉汤中，并厌氧孵育48小时。

2. 电动汽车隔离

1.离心过滤澄清细菌培养基

1. 将步骤1中接种的细菌细胞培养物通过倾倒转移到清洁250mL或500mL聚丙烯离心瓶中。在大容量固定角转子中以 4 °C 和 5,000 × g 离心瓶子 15 分钟。小心倾倒将上清液转移到干净的离心瓶中，然后再次以 10,000 × g 离心 15 分钟。
注意： 在进行符合生物安全的清洁和去污后，请重复使用瓶子。

1.如果第二次离心后存在大颗粒的细菌细胞，则在干净的瓶子中重复离心以进一步去除细胞。

2.通过倾倒将上清液转移到适当尺寸的0.22μm聚醚砜真空驱动过滤装置中。通过将过滤装置连接到真空壁电源来过滤。如果过滤率显着下降，只需将任何未过滤的材料移至新设备即可。将过滤后的培养基在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。

注意： 上述离心通常允许通过每个设备处理指定体积的 ~2 倍的细胞培养物。例如，单个 500 mL 过滤装置可以过滤 ~1,000 mL 的预离心培养物。这些设备通常不会重复使用。不建议在此步骤中使用注射器过滤器，而不进行优化，因为测试模型会发现显着损失。这是一个潜在的停止点。

3.通过将过滤后的上清液的等分试样铺在合适的琼脂平板上，检查此时活细胞是否完全去除，并确保在细菌菌株的最佳条件下孵育后没有任何菌落。如果检测到细菌，请通过执行额外的离心和/或过滤来进一步优化上述程序。

2、过滤介质的浓度

1. 如果使用体积显着 >100 mL，请继续执行步骤 2.2.2。如果使用~100mL的体积，则使用血清移液器将90mL过滤培养基加载到相应容量为100 kDa截止分子量（MWCO）的储液器上。始终使用匹配的超滤装置进行平衡，并在 4 °C 和 2,000 × g 的摆动桶转子中离心 15-30 分钟，直到顶部储液器中的培养基体积浓缩至 <0.5 mL。

1. 用任何剩余的过滤培养基加满储液器。如果“充值”，请移除设备底部的流通并重新平衡所有设备。

注意： 观察到，使用这些设备可以浓缩的过滤培养基的最大体积是推荐体积的<2倍。

2.如果储液器中浓缩介质的粘度明显增加（深色、粘性物质），则用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释并通过离心重新浓缩以稀释任何小于100 kDa的MWCO的非EV蛋白。

注意： 这是一个潜在的停止点。

3.将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。

2. 如果使用体积明显>100 mL，请选择适当尺寸的切向流过滤 （TFF） 设备 （100 kDa MWCO） 以适应要处理的体积。

注意： 用于处理 100 mL 至 >1,000 mL 的过滤装置已上市。当地可用性、成本以及与泵和管道/连接的兼容性将决定哪些特定型号最有用。在需要清洁过滤器之前，使用材料表中指示的设备处理多达 2 L 的培养基（有关清洁方案，请参阅下面的步骤 2.3）。

1. 使用 #16 低结合/低浸出管、1/8 英寸软管倒钩至鲁尔适配器、TFF 装置和蠕动泵组装过滤回路。

注意： 在生物安全柜内进行 TFF，以最大限度地降低环境细菌污染 EV 制剂的风险。

2. 在室温下，开始以大约 200 mL/min（最小 100 mL/min）的速度循环过滤的调节培养基。通过将 200 mL PBS 泵入刻度容器，确定与所需流速相对应的适当 RPM。当循环过滤的调节培养基时，将穿过超滤膜的分子<100 kDa作为废物收集在单独的容器中。

注意： 下面的示例将假设起始体积为 2 L 培养物。

3. 继续循环条件培养基，直到其体积减少到 ~ 100-200 mL。根据需要移动到较小的容器。用PBS稀释2倍，并继续与泵循环，浓缩至75-100mL。用PBS稀释2倍，并继续循环至最终体积为25mL。用PBS稀释2倍，继续循环至<10mL。

4. 将进料管从样品储液器中提起，继续泵送以吹扫过滤器并回收最大量的样品。

注意： 这是一个潜在的停止点。

5. 如果需要，将浓缩样品转移到锥形管中，并在 4 °C 下储存过夜。或者，继续执行协议。

6. 将浓缩样品移至15mL容量100 kDa MWCO离心超滤装置中。在4°C和2,000 × g的摆动桶转子中离心15-30分钟，直到顶部储液器中的培养基体积浓缩至<2mL。

注意： 这是一个潜在的停止点。

7.将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，并在4°C下储存过夜，如果需要，第二天继续该方案。

材料