来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp. (2021)
本视频展示了从基因工程细菌的外膜中分离和浓缩细胞外囊泡（EVs）的方法。该过程包括培养细菌以释放EVs，随后通过连续离心和过滤步骤去除细胞和碎片。最后，采用超滤法浓缩EVs，用于后续分析。
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方法文章
细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集
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2025年9月26日
本文内容
摘要
方案
1. 细菌菌株及培养条件
注意：本研究中使用的细菌菌株为 Escherichia coli MP1、Akkermansia mucinophila、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium breve 和 Bifidobacterium dentium。
1. 对于 E. coli，使用无菌接种环将单菌落接种到250至1,000 mL的Luria-Bertani（LB）液体培养基中，在300 rpm、37 °C条件下于摇床中振荡培养48 h，随后进行后续处理。对于重组菌株 E. coli MP1菌株携带p114-mCherryClyluc质粒，在LB琼脂和肉汤中加入氯霉素，终浓度为17 µg/mL。
2. 对于A. mucinophila、B. thetaiotaomicron、B. breve和B. dentium，在脑心浸液（BHI）琼脂平板上划线接种，并置于乙烯厌氧袋内的厌氧环境中培养。挑取单菌落接种至100 mL预还原的BHI液体培养基中，于厌氧条件下培养48 h。
2. EV 的分离
1. 通过离心和过滤澄清细菌培养基
1. 将步骤1中接种的细菌培养物通过倾倒转移至洁净的250 mL或500 mL聚丙烯离心瓶中。使用大容量固定角转子在4 °C、5,000 × g条件下离心15分钟。小心倾倒，将上清液转移至洁净的离心瓶中，再在10,000 × g条件下离心15分钟。
注意： 离心瓶经符合生物安全要求的清洗和去污染处理后可重复使用。
1. 如果第二次离心后仍有较大的细菌细胞沉淀，请在洁净的容器中重复离心，以进一步去除细胞。
2. 通过倾倒将上清液转移至适当大小的0.22 µm聚醚砜真空驱动滤器装置中。将过滤装置连接至墙壁真空源进行过滤。如果过滤速度显著下降，只需将未过滤的样品转移至新的装置中。如需，可将过滤后的培养基于4 °C过夜保存，并于次日继续后续操作步骤。
注意： 上述离心步骤通常允许每个装置处理约两倍于标示体积的细胞培养液。例如，一个500 mL的滤器装置可过滤约1,000 mL的预离心培养液。这些装置通常不重复使用。不建议在此步骤中直接使用注射器滤器，除非经过优化，因为在测试型号中观察到明显的样品损失。此步骤可作为潜在的暂停点。
3. 此时通过将过滤后的上清液等分试样涂布于合适的琼脂平板上，检查是否已完全去除活细胞，并在该细菌菌株的最佳培养条件下孵育后确保无任何菌落生长。若检测到细菌，则需进一步优化上述步骤，进行额外的离心和/或过滤操作。
2. 过滤后培养基的浓缩
1. 若处理的体积显著大于>100 mL，请进入步骤2.2.2。若处理的体积约为100 mL，使用刻度移液管将90 mL过滤后的培养基加入相应容量的100 kDa截留分子量（MWCO）离心超滤装置的储液室中。始终使用配对的超滤装置进行平衡，并在4 °C下以2,000 × g的离心力，采用摆桶转子离心15–30分钟为一个区间，直至上层储液室中的培养基体积浓缩至小于<0.5 mL。
1. 使用剩余的过滤培养基补充储液槽。若进行“补充”操作，需移除装置底部的流穿液，并重新平衡各装置。
注意： 观察到使用这些装置可浓缩过滤培养基的最大体积为 <推荐体积的2倍。
2. 如果储液池中浓缩培养基的黏度明显增加（出现深色、黏稠物质），则用磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释，并通过离心重新浓缩，以稀释分子量截留值低于100 kDa的非EV蛋白。
注意： 此处为潜在的暂停点。
3. 将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，4 °C 条件下过夜保存，如需要，可在次日继续进行后续操作。
2. 若处理的体积显著大于>100 mL，应选择合适尺寸的切向流过滤（TFF）装置（100 kDa 截留分子量）以适应待处理的体积。
注意：用于处理 100 mL 至 >1,000 mL 的过滤装置可从商业渠道获得。具体选用的型号将取决于当地的可获得性、成本以及与泵和管路/连接件的兼容性。使用材料表中所示装置，在需要清洗滤膜前，最多可处理 2 L 培养基（清洗步骤详见下文 2.3 步骤）。
1. 使用#16低吸附/低浸出管路、1/8英寸接头转鲁尔接头适配器、TFF装置和蠕动泵组装过滤回路。
注意：应在生物安全柜内进行切向流过滤（TFF），以最大限度降低环境细菌污染细胞外囊泡（EV）制备物的风险。
2. 在室温下，以约 200 mL/min（最低 100 mL/min）的流速开始循环过滤后的培养基。通过将 200 mL PBS 泵入量筒来确定与目标流速相对应的合适转速（RPM）。在循环过滤后的培养基时，将穿过超滤膜的分子量 <100 kDa 的组分作为废液收集到另一个容器中。
注意：以下示例假设起始培养液体积为 2 L。
3. 继续循环培养液，直至其体积减少至约 100–200 mL。根据需要转移至较小的容器中。用 PBS 稀释 2 倍，继续使用泵循环，浓缩至 75–100 mL。再用 PBS 稀释 2 倍，继续循环至最终体积为 25 mL。再次用 PBS 稀释 2 倍，并继续循环，直至体积小于 <10 mL。
4. 将进样管从样品储液槽中取出，并继续泵液以冲洗滤膜并最大限度回收样品。
注意： 此处为潜在的暂停点。
5. 将浓缩后的样品转移至锥形管中，如有需要，可在 4 °C 下保存过夜。或者，可继续进行后续实验步骤。
6. 将浓缩后的样品转移至一个容量为15 mL、截留分子量为100 kDa的离心超滤装置中。在4 °C条件下，使用摆桶转子以2,000 × g离心15–30分钟，重复此步骤直至上层储液室中的液体体积浓缩至<2 mL。
注意：此处为潜在的暂停点。
7. 将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，在 4 °C 下过夜保存，如需要，可在次日继续进行实验步骤。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 平盖薄壁 PCR 管 | Thermo Scientific | 3430 | 必须使用薄壁 PCR 管，以确保 Qubit 检测获得准确读数 |
| 16% 甲醛（多聚甲醛）水溶液 | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite 聚丙烯离心管 | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite 聚丙烯离心管 | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm 聚丙烯圆底/锥形瓶适配器 | Beckman Coulter | 392077 | 使 Vivacell 可适配转子 |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15（100 kDa 截留分子量） | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI 离心机 | Beckman Coulter | Beckman 已不再销售该型号，Avanti J-26XP 为最接近的现售型号 | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| 脑心浸液（BHI）肉汤 | Himedia | M2101 | 高压灭菌后，将 BHI 肉汤和琼脂引入厌氧室，并添加甲萘醌（1 µg/L）、血红素（1.2 µg/L）和盐酸半胱氨酸（0.05%）。然后在厌氧条件下孵育至少 24 小时，再接种厌氧菌株 |
| C-300 微流控芯片 | Spectradyne | ||
| 氯霉素 | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08（Steller 感受态细胞） | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Mark Goulian 博士（赠品） | 源自小鼠肠道的共生细菌 | |
| Fiberlite 500 mL 转 250 mL 适配器 | ThermoFisher | 010-0151-05 | 与 Fiberlite 转子配合使用，使 250 mL 离心管可用于体积较小的起始细菌培养物 |
| Fiberlite 固定角转子 | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | 可容纳 6 个 500 mL 离心管 |
| LB 肉汤（Miller 配方） | Difco | 244620 |
