使用尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡

摘要

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用多孔树脂珠进行尺寸排阻色谱，以从细菌培养滤液中分离细菌胞外囊泡（EVs）。较大的EVs因无法进入树脂孔隙而较早洗脱，较小的蛋白质则进入孔隙并在之后洗脱。

方案

1. 凝胶过滤层析（SEC）
注意：凝胶过滤层析用于提高细胞外囊泡（EVs）的纯度，并去除非囊泡蛋白。

1. 使用小型尺寸排阻色谱柱（10 mL 床体积）从 <100 mL 起始材料中分离细胞外囊泡（EVs），使用较大色谱柱（47 mL 床体积）从 >100 mL 起始材料中分离 EVs。
   注意：以下示例列出的是较大色谱柱的体积，括号内为较小色谱柱的对应体积。
2. 将尺寸排阻色谱柱和磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下平衡数小时。使用标准实验室支架和夹具将色谱柱固定于垂直位置，也可使用商用色谱柱支架。
3. 在连接色谱柱之前，先让 5 mL PBS 流经烧结滤板进入废液容器，以润洗样品储液槽。拧开色谱柱的入口盖，向样品储液槽中加入 2 mL PBS，并在 PBS 通过烧结滤板滴出时，小心地将储液槽连接至色谱柱（此步骤不适用于小型 SEC 柱）。注意：上述步骤可防止空气泡滞留在 SEC 柱顶部。若已有气泡滞留，应取下储液槽，轻敲色谱柱以排出气泡，然后重复连接操作。对于小型色谱柱，只需打开 SEC 柱顶部盖子，然后连接样品加样漏斗即可。
4. 向样品储液槽中加入 47 mL（10 mL）PBS，并打开 SEC 柱底部出口。让所有加载的缓冲液流过色谱柱以完成平衡，弃去流出液。
5. 将最多 2 mL（0.5 mL）样品加入样品储液槽，弃去流出液，使样品完全进入色谱柱。
6. 立即向样品储液槽或加样漏斗中加入体积为 14.25 mL 减去样品体积的 PBS（小型色谱柱为 3 mL 减去样品体积）。让溶液流过色谱柱，并弃去相当于柱空体积的初始流出液。
   注意：对于典型的 2 mL 样品，需向样品储液槽或加样漏斗中加入 12.25 mL PBS。
7. 将一个 2 mL 低吸附微量离心管置于 SEC 柱正下方。立即向样品储液槽中加入 2 mL（0.5 mL）PBS，并使其完全进入色谱柱。将前 2 mL（0.5 mL）流出液标记为 第 1 馏分。随后每次向样品储液槽中加入 2 mL（0.5 mL）PBS，依次收集后续各馏分。
   注意：大多数细菌来源的 EVs 在前 5 个馏分中洗脱。在优化过程中，共收集了前 12 个馏分。
8. 将收集的馏分在 4 °C 下短期保存（数天），或在 -80 °C 下长期保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qEV original，35 nm	Izon		最大上样体积为 0.5 mL
qEV 架	Izon		与 qEV-original SEC 色谱柱配合使用
qEV-2，35 nm	Izon		最大上样体积为 2 mL
Protein LoBind，2.0 mL，PCR 洁净管	Eppendorf	30108450