使用尺寸排阻色谱法分离细菌细胞外囊泡

摘要

资料来源： Watson， DC 等人。从大肠杆菌和其他细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡。 J. Vis. Exp. （2021年）

该视频演示了如何使用带有多孔树脂珠的尺寸排阻色谱法从细菌培养滤液中分离细菌细胞外囊泡 （EV）。较大的 EV 通过绕过树脂孔提前洗脱，而较小的蛋白质进入孔隙并稍后洗脱。

方案

1. 尺寸排阻色谱 （SEC）
注意： SEC 用于提高细胞外囊泡 （EV） 的纯度并去除非囊泡蛋白。

1. 使用小型SEC色谱柱（10 mL床体积）从<100 mL起始材料中分离EV，使用较大的色谱柱（47 mL床体积）从>100 mL起始材料中分离EV。
   注意： 下面的示例将列出较大列的卷，括号中列出较小列的卷。
2. 将 SEC 色谱柱和磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 置于室温数小时。使用标准实验室支架和支架将SEC色谱柱稳定在垂直位置。或者，使用商用色谱柱支架。
3. 在连接到SEC色谱柱之前，通过让5 mL PBS流过筛板并进入废物容器来水合样品储液器。拧下 SEC 色谱柱的进样口盖，向样品储液器中加入 2 mL PBS，并在 PBS 通过筛板滴出时小心地将储液器连接到色谱柱（不适用于小型 SEC 色谱柱）。 注意： 上一步可防止任何气泡被困在 SEC 色谱柱的顶部。如果空气被困住，请取下储液器，轻敲色谱柱以取出气泡，然后重复连接过程。对于较小的色谱柱，只需打开 SEC 色谱柱顶部的盖子，然后连接样品料斗。
4. 向样品储液器中加入 47 mL （10 mL） PBS，并打开 SEC 色谱柱底部的盖子。让所有加载的样品缓冲液流过色谱柱以进行平衡。丢弃流通。
5. 将最多 2 mL （0.5 mL） 的样品加载到样品储液器中，丢弃流通，让样品完全进入色谱柱。
6. 立即将 PBS 以 14.25 mL 减去样品体积（小色谱柱为 3 mL 减去样品体积）的体积添加到样品储液器或料斗中。让溶液流过色谱柱，并丢弃等于色谱柱空隙体积的量。
   注意： 对于典型的 2 mL 样品，要添加到样品储液器或料斗中的 PBS 量为 12.25 mL。
7. 将 2 mL 低结合微管直接放置在 SEC 色谱柱下方。立即将 2 mL （0.5 mL） PBS 添加到样品储液器中，并使其进入色谱柱。将前 2 mL （0.5 mL） 的流通标记为 馏分 1。继续向样品储液器中一次添加 2 mL （0.5 mL） 以收集每个后续馏分。
   注意： 大多数细菌 EV 在前 5 个馏分中洗脱。在优化过程中，收集了前 12 个馏分。
8. 将馏分储存在 4 °C 以进行短期储存（天）或将馏分储存在 -80 °C 以进行长期储存。

材料