通过免疫突触形成的体外细菌转感染T细胞

摘要

来源：Cruz-Adalia, A., et al. T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了通过抗原特异性T细胞与树突状细胞相互作用实现的细菌转感染过程。将携带卵清蛋白肽的细菌感染树突状细胞与T细胞共同孵育，孵育方式可为直接接触，也可通过膜隔开。直接接触可形成免疫突触，从而实现细菌转移；而使用膜则可阻止细胞间相互作用。随后进行庆大霉素处理，以清除胞外细菌。

方案

注意：小鼠在特定病原体阴性（SPF）环境中饲养，并由经过培训且具备资质的人员采用二氧化碳（CO₂）吸入法实施安乐死。
1. 小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）的分化与感染注意：图1总结了该第一步。自此之后，所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的分化
   1. 取一只C57/BL6小鼠的胫骨和股骨，解剖后转移至含10 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基的塑料培养皿中。
   2. 用无菌剪刀剪去每块骨的骨骺端，暴露具有特征性鲜红色的骨髓组织。
   3. 在无菌培养皿中，使用无菌注射器将10 ml含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS/BSA/EDTA缓冲液）注入骨髓腔内。
   4. 收集细胞悬液，于4 °C条件下以600 × g离心。
   5. 用1 ml氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（0.15 M氯化铵（NH₄Cl）、10 mM碳酸氢钾（KHCO₃）和0.1 mM EDTA）重悬细胞，在室温（RT）孵育30秒以去除红细胞。
   6. 加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，通过....

结果

图1. 树突状细胞制备与CD4⁺ T细胞分离的流程图。 图的左侧详细展示了从骨髓细胞分化获得树突状细胞（DCs）的过程。首先解剖股骨和胫骨，从骨髓腔中提取骨髓细胞。随后裂解红细胞（RBC），并将骨髓细胞在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养9天。待细胞充分分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	费舍尔科技	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	西格玛	L2630-10mg
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	SH3023901
2-ME	吉布科	31350-010
OVAp OTII (323–339)	金斯瑞	---
70 µm 细胞筛	BD	352350
30 µm 注射器滤器 无菌	BD	340598
AutoMacs Classic	美天旎生物技术	130-088-887
庆大霉素	诺蒙	624601.6
Transwell	康宁	3415
LB	Pronadisa	1231
琼脂	Pronadisa	1800
16% 戊二醛	电子显微镜科学	15710
吐温 X-100
CD8 生物素标记	BD 生物科学	553029
IgM 生物素标记	ImmunoStep	克隆 RMM-1
B220 生物素标记	BD 生物科学	553086
CD19 生物素标记	BD 生物科学	553784
MHC-II 生物素标记 (I-A/I-E)	BD 生物科学	553622
CD11b 生物素标记	ImmunoStep	11BB-01mg
CD11c 生物素标记	ImmunoStep	11CB3-01mg
DX5 生物素标记	BD 生物科学	553856
Gr-1 生物素标记	BD 生物科学	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
抗沙门氏菌抗体	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD 生物科学	553802
CD4-APC	Tonbo 生物科学	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD 生物科学	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD 生物科学	553623
Alexa-Fluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附	英潍捷基	A-21245
CMAC (7-氨基-4-氯甲基香豆素)	生命科技	C2110
BSA	西格玛	A7030-100G
链霉亲和素微珠	美天旎生物技术	130-048-101
BD FACSCanto II	BD 生物科学	---