通过免疫突触形成的体外细菌转感染T细胞

摘要

来源：Cruz-Adalia, A., et al. T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了通过抗原特异性T细胞与树突状细胞相互作用实现的细菌转感染过程。将携带卵清蛋白肽的细菌感染树突状细胞与T细胞共同孵育，孵育方式可为直接接触，也可通过膜隔开。直接接触可形成免疫突触，从而实现细菌转移；而使用膜则可阻止细胞间相互作用。随后进行庆大霉素处理，以清除胞外细菌。

方案

注意：小鼠在特定病原体阴性（SPF）环境中饲养，并由经过培训且具备资质的人员采用二氧化碳（CO₂）吸入法实施安乐死。
1. 小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）的分化与感染注意：图1总结了该第一步。自此之后，所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的分化
   1. 取一只C57/BL6小鼠的胫骨和股骨，解剖后转移至含10 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基的塑料培养皿中。
   2. 用无菌剪刀剪去每块骨的骨骺端，暴露具有特征性鲜红色的骨髓组织。
   3. 在无菌培养皿中，使用无菌注射器将10 ml含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS/BSA/EDTA缓冲液）注入骨髓腔内。
   4. 收集细胞悬液，于4 °C条件下以600 × g离心。
   5. 用1 ml氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（0.15 M氯化铵（NH₄Cl）、10 mM碳酸氢钾（KHCO₃）和0.1 mM EDTA）重悬细胞，在室温（RT）孵育30秒以去除红细胞。
   6. 加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，通过细胞滤器（70 μm）过滤以去除骨碎片和细胞团块，然后以相同速度（600 × g）离心，因过滤已去除团块。
   7. 计数细胞，并用含10% FBS的RPMI培养基（含50 μM β-巯基乙醇、1 mM丙酮酸钠）调整细胞浓度至5 × 10⁵ 个细胞/ml，再加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rm-GM-CSF）至终浓度为20 ng/ml。
   8. 将上述细胞悬液加入无菌微生物级15 cm培养皿中，在CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养。
   9. 每隔三天，将非贴壁细胞及脱落细胞用含5 mM EDTA的PBS收集，离心后以5 × 10⁵ 个细胞/ml的密度重悬于含20 ng/ml rm-GM-CSF的新鲜培养基中继续培养。
2. 树突状细胞成熟与抗原负载
   1. 第9天，将细胞以5 × 10⁵ 个细胞/ml的密度重悬于含20 ng/ml rm-GM-CSF的培养基中，随后加入20 ng/ml脂多糖（LPS），以促进细胞表面主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）的高表达，并在未经组织培养处理的无菌15 cm培养皿中孵育24小时。
   2. 经LPS刺激24小时后，取部分DC细胞用抗小鼠CD11c、MHC-II和粒细胞受体-1（Gr-1）抗体染色，通过流式细胞术检测DC分化情况。DC流式细胞术分析示例见图3A 和3B。
      1. 将DC细胞（每样本5 × 10⁵ 个细胞）与抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体在50 μl PBS/BSA/EDTA缓冲液中孵育，终浓度为2.5 μg/ml。随后，分别在PBS/BSA/EDTA缓冲液中加入不同荧光染料标记的MHC-II（I-A/I-E）、CD11c和Gr-1抗体，稀释比例分别为1:100、1:200和1:500，每样本50 μl。
      2. 最后，用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤DC细胞，并按照制造商说明书进行流式细胞术分析。
         注意：若细胞分化良好，则可进行抗原负载。
   3. 用不含抗生素的RPMI 10% FBS培养基洗涤DC细胞，然后在每1 ml含10% FBS的RPMI培养基中加入10 μg/ml卵清蛋白OTII肽（OVAp）（OVA 323-339；I S Q A V H A A H A E I N E A G R），每5 × 10⁶ 个DC细胞置于塑料管中，于37 °C孵育至少1小时。作为阴性对照，DC细胞不加OVAp孵育。
3. DC细胞感染
   1. 在CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中，以感染复数（MOI）为10（每DC细胞10个细菌）的比例感染DC细胞，持续1小时。
   2. 用PBS洗涤DC细胞3次，再用含10% FBS的RPMI培养基洗涤1次，以450 × g离心，以去除大部分胞外细菌。最后，将细胞重悬于不含抗生素的RPMI 10% FBS培养基中，浓度为20 × 10⁶ 个细胞/ml。

2. 从OTII转基因小鼠中分离CD4⁺ T淋巴细胞说明：图1总结了此第二步。应使用淋巴结而非脾脏来分离CD4⁺ T细胞，因为淋巴结中CD4⁺淋巴细胞的比例（约50%）高于脾脏（约25%），因此纯化效率更高。

1. 制备淋巴结单细胞悬液
   1. 从OTII转基因小鼠中取出腹股沟、腋窝、臂部、颈部及肠系膜淋巴结，并转移至含10 ml RPMI 10% FBS培养基的塑料培养皿中。
   2. 在无菌操作台中使用两张磨砂载玻片研磨淋巴结。将淋巴结置于一张磨砂载玻片的磨砂面上，用另一张磨砂载玻片的磨砂面摩擦，直至组织完全研碎。
   3. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤单细胞悬液。
   4. 将细胞通过70 μm细胞筛过滤，以去除结缔组织，并用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤。
   5. 将细胞重悬于1 ml ACK裂解缓冲液中，室温孵育1分钟以去除红细胞。
2. CD4⁺ T细胞的分离
   1. 同步骤2.1.3再次洗涤细胞，计数后用PBS/BSA/EDTA缓冲液重悬至100 × 10⁶ 细胞/ml。在冰上加入以下生物素标记的抗体（稀释比1:250），包括抗CD8、IgM、B220、CD19、MHC II类分子（I-Ab）、CD11b、CD11c和DX5抗体，孵育30分钟，用于后续CD4⁺ T细胞的阴性筛选。
   2. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤细胞，然后将细胞（100 × 10⁶ 细胞/ml）与链霉亲和素磁珠按制造商说明书推荐浓度在冰上孵育15分钟。
   3. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤细胞，并在CD4⁺ T细胞分离前通过30 μm细胞筛过滤。
   4. 根据制造商说明书，使用磁性细胞分选仪通过阴性选择法分离CD4⁺ T细胞。
   5. 计数细胞，并用RPMI 10% FBS培养基（不含抗生素）调整细胞浓度至4 × 10⁶ 细胞/ml。
   6. 取分离的CD4⁺ T细胞（3 × 10⁵ 细胞）进行固定并冰上保存，用于流式细胞仪检测纯度。CD4⁺ T细胞纯化的示例见图3C。

3. 通过庆大霉素保护实验测量T细胞的转感染 注：图2 概括了本实验方案的第三步。

1. T 细胞转感染

1. 在CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中，将分离的CD4⁺ T细胞与感染的DC细胞（1:1）共孵育30分钟，以诱导免疫突触形成（DC细胞经感染1小时后洗涤以去除游离细菌）。

2. 在24孔培养板中加入0.5 ml分离的CD4⁺ T细胞（2 × 10⁶ 个细胞）和0.1 ml感染的DC细胞（2 × 10⁶ 个细胞）。作为阴性对照，以感染复数（MOI）为10个细菌的条件，直接感染0.5 ml CD4⁺ T细胞，孵育30分钟。

3. 使用聚碳酸酯 transwell 隔膜（孔径为 3 μm）将感染的树突状细胞（DC）与 T 细胞分隔，以阻断 DC 与 T 细胞之间的直接接触，设置额外的对照组。将 0.1 ml 的 DC 加入 transwell 内，将 0.5 ml 的 CD4⁺ T 细胞加入孔板下室（24 孔板）。

4. 最后，用RMPI培养基补足至每孔0.6 ml，使所有样品的体积相等。

5. 免疫突触形成30分钟后，加入100 μg/ml的庆大霉素，在CO₂培养箱（37°C，5% CO₂）中孵育1小时，然后收集细胞。

结果

图1. 树突状细胞制备与CD4⁺ T细胞分离的流程图。 图的左侧详细展示了从骨髓细胞分化获得树突状细胞（DCs）的过程。首先解剖股骨和胫骨，从骨髓腔中提取骨髓细胞。随后裂解红细胞（RBC），并将骨髓细胞在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养9天。待细胞充分分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	费舍尔科技	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	西格玛	L2630-10mg
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	SH3023901
2-ME	吉布科	31350-010
OVAp OTII (323–339)	金斯瑞	---
70 µm 细胞筛	BD	352350
30 µm 注射器滤器 无菌	BD	340598
AutoMacs Classic	美天旎生物技术	130-088-887
庆大霉素	诺蒙	624601.6
Transwell	康宁	3415
LB	Pronadisa	1231
琼脂	Pronadisa	1800
16% 戊二醛	电子显微镜科学	15710
吐温 X-100
CD8 生物素标记	BD 生物科学	553029
IgM 生物素标记	ImmunoStep	克隆 RMM-1
B220 生物素标记	BD 生物科学	553086
CD19 生物素标记	BD 生物科学	553784
MHC-II 生物素标记 (I-A/I-E)	BD 生物科学	553622
CD11b 生物素标记	ImmunoStep	11BB-01mg
CD11c 生物素标记	ImmunoStep	11CB3-01mg
DX5 生物素标记	BD 生物科学	553856
Gr-1 生物素标记	BD 生物科学	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
抗沙门氏菌抗体	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD 生物科学	553802
CD4-APC	Tonbo 生物科学	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD 生物科学	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD 生物科学	553623
Alexa-Fluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附	英潍捷基	A-21245
CMAC (7-氨基-4-氯甲基香豆素)	生命科技	C2110
BSA	西格玛	A7030-100G
链霉亲和素微珠	美天旎生物技术	130-048-101
BD FACSCanto II	BD 生物科学	---