使用聚焦光照进行丝状蓝细菌趋光性实验

摘要

来源：Weber, N. et. al., 丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白质表达与低温保存。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种基于聚焦LED的检测方法，用于研究丝状蓝细菌的趋光性。细菌向光源方向迁移，并在受光照的中心区域形成密集的聚集，通过分析所捕获图像的像素强度，可对这一现象进行可视化和定量。

方案

1. 趋光性测定
   1. 进行趋光性实验时，制备发光二极管（LED）支架（此处使用3D打印机打印），将选定的5 mm LED安装在支架上，从下方至上方照射20 mm²的区域（图1）。如有需要，可并行使用多个LED支架，每个LED通过电阻和电位器连接至可调电源。根据实验需求测量并调节LED的光强。确保整个装置置于暗室或封闭的暗盒中。
   2. 将含有Phormidium lacuna的8 mL培养基加入6 cm培养皿中。调节LED的光照强度。盖上培养皿盖子，并将其放置在LED支架上，使LED位于培养皿正中央。
   3. 经过所需时间（通常为2天）后，使用智能手机摄像头正对光照处理位置拍摄培养皿图像。使用白色LED面板照射样品。采用相机的手动设置，避免光线反射；始终确保相机镜头与样品之间的距离保持一致。确保曝光参数所获得的图像适用于后续使用ImageJ进行分析。
   4. 使用ImageJ软件量化丝状体中央区域的直径。
      1. 打开ImageJ，点击文件 | 打开，选择目标文件，然后点击回车。
      2. 选择直线按钮（带直线图标）。按住鼠标左键，从培养皿一端画一条直线至另一端，确保直线穿过丝状体圆圈的中心。
      3. 按下键盘上的Ctrl-K，或在ImageJ菜单中点击分析 | 拓展轮廓图，查看显示像素强度随距离变化的x-y窗口——即培养皿的一维强度分布图。确保最低像素强度略高于0，最高值低于255。
      4. 估算圆圈外部区域的平均像素强度值，以及圆圈内部区域的平均像素强度值。在y轴上这两个强度值之间的位置，用鼠标指向该处，估算圆圈两侧对应的x值。记录这两个数值并计算其差值。
      5. 将鼠标指向右侧y轴最远端，获取最大的x值。记录该值e，其代表培养皿的直径。若该直径为5 cm，则中央丝状体圆圈的直径按公式d/e × 5 cm计算得出。

结果

图1：趋光性实验。 左图：带有4个红色LED的LED支架，连接至可调电源。每个LED上方放置一个直径6 cm的培养皿，内含8 mL沼丝藻（Phormidium lacuna）培养物。右图：沼丝藻（P. lacuna）在红光LED（15 µmol m^-2 s^-1）照射下培养2天后的状态。缩写：LED = 发光二极管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿 聚苯乙烯，60 mm × 15 mm	Merck	P5481-500EA
分光光度计 Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
分光光度计 Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
移液器 Pipetman 10–100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
软件，网址
ImageJ		图像处理软件（用于像素强度、圆直径分析）
培养基
f/2 液体培养基	人工海水，0.1 % (v/v) 微量元素溶液，0.05 % (v/v) 维生素溶液，0.88 mM 硝酸钠，36 µM 磷酸二氢钠